Diagnostika běžných orálních nemocí pomocí signaturních těkavých profilů

Lékaři ve starověkém Řecku chápali, že čichání dechu jejich pacientů může pomoci při diagnostice. I když se tato poměrně primitivní diagnostická metoda v průběhu staletí příliš nezměnila, v posledních letech roste zájem o zdokonalování metod neinvazivní včasné diagnostiky u řady metabolických a infekčních onemocnění.

V současné době je mnoho nemocí vynecháno a zhoršováno kvůli opožděné diagnóze. V zubní medicíně mají pacienti tendenci vyhýbat se návštěvám svého zubního lékaře i kvůli pravidelným prohlídkám, a proto se na klinice dostavují až v pozdějším, pokročilém stadiu onemocnění, trpí bolestmi a nepohodlím, kterým se dalo snadno předejít, a projevují se v pozdním stádiu onemocnění, a tím ohrozit výsledek léčby.

Z těchto důvodů existuje naléhavá potřeba levné a minimálně invazivní technologie, která by sloužila jako diagnostická pomůcka umožňující 1) účinnou včasnou detekci a 2) přizpůsobení léčby.

Odpovědí na výše uvedenou potřebu mohou být diagnostické modality založené na detekci těkavých organických sloučenin (dále jen VOC), tedy organických sloučenin s relativně vysokým tlakem par při pokojové teplotě.

"Elektronické nosy" pro detekci těkavých organických sloučenin ve vydechovaném vzduchu Těkavé organické sloučeniny specifické pro onemocnění jsou produkovány zejména změnami specifických biochemických drah v těle. Po jejich produkci lidskými nebo bakteriálními buňkami se VOC mohou nacházet mimo jiné v tělesných tekutinách, včetně infikovaných buněk a/nebo jejich mikroprostředí, krvi, dechu a slinách. VOC uvolněné z jejich původu tak mohou být přímo detekovány z krve a horního prostoru buněk.

Četné světové výzkumné skupiny zkoumají možnost neinvazivní detekce VOC ve vydechovaném vzduchu, což umožňuje diagnostiku různých systémových onemocnění6, včetně karcinomů (plíce, prsu a kolorektálního karcinomu), tuberkulózy, selhání ledvin a astmatu. Dotčenými VOC jsou alkany (C4-C20), methylalkeny a deriváty benzenu, které se u zdravých jedinců nacházejí v koncentracích 1-20 ppb (části na miliardu), zatímco u onemocnění je koncentrace VOC specifických pro onemocnění zvýšená. Předpokládá se, že VOC jsou produkovány postiženou tkání v důsledku oxidačního stresu, játry jako součást metabolické reakce nebo imunitním systémem.

"Elektronický nos" je zařízení schopné rozpoznat těkavé složení vzorku vzduchu. Zařízení se skládá z řady nanoreceptorů schopných transformovat fyzikální nebo chemické informace na elektrický signál. Každý receptor v poli reaguje odlišně na materiály v analyzovaném vzorku a kombinace těchto reakcí z několika receptorů vytváří jedinečný profil těkavých látek, který lze odlišit kvalitou (jmenovitě, které molekuly se nacházejí ve vzorku?) a kvantitou (jmenovitě, jaká je přesná koncentrace každé molekuly?).

Elektronický nosní systém pro analýzu vzorků vzduchu by se měl obvykle skládat ze tří klíčových součástí:

1. Zařízení pro sběr dechu / headspace
2. Zařízení na zpracování
3. Klasifikační algoritmus. První a nejrozšířenější taková zařízení jsou založena na analýze vzorků vzduchu v systému plynové chromatografie / hmotnostní spektrometrie (GC-MS). Mezi pokročilé systémy patří methyl-oxidové senzory (MOS) nebo nanoreceptory.

V laboratoři co-PI (Prof. Haick, Fakulta chemického inženýrství, Technion, Haifa, Izrael), schopný detekovat stopy VOC v koncentracích jednotlivých dílů na miliardu (1 µg/l). Ve spojení s počítačovým systémem schopným analyzovat velké množství dat ze stovek molekul, detekovaných současně polem 20 nebo více receptorů, tento systém překonává ostatní zařízení „elektronického nosu“ z hlediska citlivosti a účinnosti. Na rozdíl od nákladných a pomalých systémů GC-MS by ideální senzor na bázi nanomateriálů pro dechové zkoušky měl být citlivý na velmi nízké koncentrace těkavých organických sloučenin, a to i v přítomnosti okolních nebo fyziologických matoucích faktorů. Měl by také rychle a úměrně reagovat na malé změny koncentrace a poskytovat konzistentní výstup, který je specifický pro danou sloučeninu. Když není senzor v kontaktu s dotyčnými sloučeninami, měl by se rychle vrátit do svého základního stavu nebo by měl být dostatečně jednoduchý a levný na to, aby byl jednorázový.

Odběr vzorků vzduchu s takovými receptory by měl být srovnatelně jednoduchý a jeho výsledky lze interpretovat automaticky, což jej činí vhodným pro nákladově efektivní screening velkých populací. Pouze pozitivně testovaní pacienti budou vyžadovat konvenční a nepříjemnou diagnostiku k potvrzení včasné diagnózy před navržením léčby.

Nicméně všechny existující diagnostické modality založené na VOC mají tendenci zapomínat, že vydechovaný vzduch je kombinací mnoha původů – plíce, horní GI trakt a dutina ústní s malou nosní složkou. Zatímco složení a těkavé profily vzduchu z plic byly v nedávném desetiletí důkladně prozkoumány jako prostředek k nalezení včasného diagnostického přístupu k rakovině10,15, orální složka zůstala z velké části nedotčena.

Mikro niky v ústní dutině zdravých jedinců obsahují biofilm, který může obsahovat více než 1000 různých bakteriálních druhů. Při absenci aktivního mechanického nebo chemického čištění se biofilm hromadí, mění a dozrává, což způsobuje zánět měkkých tkání, známý jako gingivitida. U některých jedinců a za určitých podmínek zánět progreduje do periodontálního onemocnění a složení biofilmu se mění na vyšší podíl anaerobních gramnegativních bakterií se zvýšenou virulencí a schopností lámání tkání. Kromě biofilmových mikroorganismů mohou další zdroje VOC v ústní dutině zahrnovat sérum, gingivální exsudát, zanícenou tkáň dásní, vředy a léze, patologické stavy spojené se slinnými žlázami, dutinami a nosní dutinou, gastrointestinální reflux, mezizubní zachycené zbytky potravy a znečištění životního prostředí. . Hertel a kol. nedávno oznámila unikátní profily těkavých látek v horním prostoru specifických ústních bakterií a hub.

Předpokládáme, že volatolomika založená na nanoreceptorech může být použita jako diagnostická modalita pro neinvazivní včasnou diagnostiku onemocnění dutiny ústní na základě vzorku vydechovaného vzduchu.

Navrhovaný výzkum si klade za cíl položit základy pro rychlou, uživatelsky přívětivou a neinvazivní diagnostickou modalitu pro běžná onemocnění dutiny ústní ve vzorcích vydechovaného vzduchu na bázi NaNose. To poslouží v dohledné době jako základ pro vytvoření komerčního klinického nebo domácího diagnostického zařízení.

Konkrétní cíle:

1. Detekce a analýza VOC spojených s běžnými onemocněními dutiny ústní v headspace vzorků mikroorganismů z ústní dutiny pacientů s diagnostikovanou gingivitidou, periodontálním onemocněním nebo kazem a srovnání s kontrolní skupinou zdravých pacientů.
2. Charakterizace těkavých profilů pro běžná onemocnění dutiny ústní a definování specifikovaných diagnostických nanoreceptorů.

Požadované výsledky

1. Výsledky navrhovaného výzkumu mohou vést k revoluci mezi zubními profesionály i v domácí péči. K dnešnímu dni je jediným způsobem, jak se jedinec dozvědět o svém stavu ústní dutiny, domluvit si schůzku se zubařem, přesto se značná část populace vyhýbá pravidelným prohlídkám a léčbě. Snadný nástroj umožňující jednoduchý a neinvazivní odběr vzorků vzduchu doma nebo v lékárně výrazně zvýší míru kompliance a léčitelnosti pacientů a sníží výdaje na zdravotní péči.
2. Mapování VOC vzduchu pocházejícího z dutiny ústní může zvýšit diagnostickou hodnotu vzorků vzduchu pocházejících z plic a zlepšit tak přesnost, senzitivitu a specificitu neinvazivní včasné diagnostiky rakoviny, selhání ledvin a dalších interních onemocnění.

Metody

Fáze 1 - Detekce a analýza VOC spojených s běžnými onemocněními dutiny ústní Známé bakteriální kmeny (Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Acinetobacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, obsahující lahvové bacilly budou kultivovány samostatně) sběr a analýza jedinečného headspace uvnitř lahví. Po kultivaci bude headspace shromážděn do Tenax absorpční zkumavky (Sigma-Aldrich, 28718-U SUPELCOTenax® TA / Carboxen® 1018) a analyzován v GC-MS (plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie). Statistickou analýzou bude stanoven jedinečný profil těkavých látek každého bakteriálního kmene. Kompletní zkušební protokol je k dispozici v dodatku 1 níže.

S každým kmenem budou provedena tři (3) opakování.

Fáze 2 - Charakterizace těkavých profilů pro běžná onemocnění dutiny ústní a definování specifikovaných diagnostických nanoreceptorů Testované vzorky budou orálního bakteriálního plaku a infikovaného dentinu, kultivované v uzavřených lahvích podobně jako ve Fázi 1.

Pacienti budou pocházet ze studentských klinik a vzorky budou odebírány v rámci jejich zubního ošetření, a to: odstranění kazu a infikovaného dentinu pro budoucí obnovu a odstranění zubního kamene a plaku pro léčbu onemocnění parodontu.

1. Na začátku léčebného sezení bude od pacienta získán informovaný souhlas, který souhlasí s použitím odstraněného plaku / infikovaného dentinu ve výzkumu. Neočekává se žádná odchylka od standardního léčebného protokolu.

   1. Vzorek plaku u pacientů s parodontem bude odebrán před zahájením hrubého škálování pomocí ručního nástroje (Gracey 5-6 kyreta) z cervikální oblasti mandibulárních řezáků.
   2. Vzorek infikovaného dentinu z kariézních zubů bude odebrán ručním nástrojem (Lžícový bagr) po vytyčení výchozí formy preparované kavity.
2. Odebrané vzorky budou poté kultivovány v uzavřených lahvích obsahujících Wilkins-Chalgrenovo médium při 37 °C po dobu 48 hodin, podobně jako ve fázi 1 výše. Jako kontrola bude použita lahvička se sterilním médiem.
3. Headspace bude poté shromážděn a analyzován podobně jako body 5-8 ve fázi 1 výše.
4. V tomto okamžiku bude jedinečný profil těkavých látek každého pacienta spojen s jeho klinickou diagnózou (rozsah onemocnění parodontu / kazu) a analyzován pro statistickou konzistenci.
5. Data shromážděná ve fázích 1-2 budou statisticky analyzována jako celek.