Virkningen af ​​direktevirkende antivirale lægemidler på mønstrene af tarmmikrobiota hos patienter med HCV-relaterede kroniske leversygdomme

Det er en casekontrolundersøgelse, der blev udført på 8 ikke-cirrhotiske kronisk inficerede patienter med hepatitis C-virus (gruppe I), 4 patienter med succes behandlet fra HCV efter modtagelse af 12 ugers DAA'er (sofosbuvir, Daclatasvir), der opnåede vedvarende viral respons (gruppe II), og 4 patienter, der var ved at vende tilbage efter 12 uger fra DAAS (Sofosbuvir/Velpatasvir/voxilaprevir) (gruppe III). Fjorten sunde kontrolpersoner, der blev matchet til alder og køn (gruppe VI), blev tilmeldt efter at have fået deres informerede samtykke. Detaljeret historieoptagelse, klinisk undersøgelse, abdominal ultralyd (U/S) og laboratorieundersøgelser, herunder komplet blodantal (CBC), leverfunktionstest og serumtransaminaser blev bestemt for alle patienter.

Inkluderingskriterier: Patienter i enhver alder eller køn, der blev bevist at være inficeret med hepatitis C -virus uden behandling, dem, der modtog behandling og vedvarende viral respons og dem, der modtog behandling og tilbagefaldende og sunde kontroller, blev tilmeldt undersøgelsen af ​​undersøgelsen af ​​undersøgelsen, der fik antibiotikabehandling, probiotika eller enhver anden medicinsk behandling, der påvirkede intestinal mikrobiota 1 måned før starten af ​​undersøgelsen af ​​undersøgelsen af ​​undersøgelsen af ​​patienter med patienter med patienter med nogen andre virale infektioner, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, og HB, OG HIV blev udelukket.

Prøveopsamling Friske afføringsprøver blev opsamlet om morgenen fra alle deltagere og blev behandlet inden for 1 time efter afføring. En aseptisk teknik blev anvendt til indsamling af alle prøver, med omhu taget for at undgå forurening.

Også 5 ml venøst ​​blod under aseptiske forhold blev opsamlet fra hver patient til estimering af de forskellige laboratorieparametre.

1.4: Kvantitativ vurdering af RNA-virusbelastning HCV-RNA-niveau blev påvist under anvendelse af realtids polymerasekædereaktion (RT-PCR) (Bioline International, UK) med en nedre påvisning af 15 IE/ml. (Alter., 2007).

1.5: Microbiota -profilering 1.5.1.DNA -ekstraktion

Umiddelbart efter indsamling blev genomisk DNA ekstraheret fra afføringsprøverne under anvendelse af Invitrogen Purelink Microbiome DNA -rensningssæt (Thermo Fisher Scientific, CAT #A29790). Udføringsprøverne blev blandet grundigt for at skabe en homogen prøve, før de vejer og overførte den målte mængde af fæces (0,2 ± 0,05 g) til perlerøret, så fulgte vi instruktioner som anført af producenten som følger:

Vi udførte proceduren ved stuetemperatur (20-25 ºC) .1. Lysatet blev fremstillet som følgende:

1. Prøve (0,2 ± 0,05 g) og S1-Lysis-puffer (600 µl) blev tilsat til perlerøret, den samlede blanding var 800 µl,
2. Perlerørene blev hvirvlet for at sikre, at prøverne blev grundigt spredt i væsken.
3. Hundrede µl S2 -lysisforstærker blev tilsat og hvirvlet kort.

e. Perlerør blev hvirvlet i 10 minutter med maksimal hastighed på hvirvelmikseren ved hjælp af håndfri adapter og vandret omrøring.

f. Perlerørene blev centrifugeret ved 14.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.

g. Derefter blev 400 µl af supernatanten overført til et rent mikrocentrifuge -rør.

h. Derefter blev 250 µl S3-oprydningsbuffer tilsat til rørene og hvirvlet straks for at sikre jævn spredning af S3 og ensartet nedbør af hæmmere.

jeg. Perlerørene blev centrifugeret ved 14.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur.

j. Derefter blev 500 µl af supernatanten overført til et rent mikrocentrifugerør med omhu for at undgå pelleten og ethvert affald.

2.. Derefter var DNA bundet til kolonnen som følger:

1. I alt 900 µl S4-bindende buffer blev tilsat til rørene og hvirvlet kort.
2. Derefter blev 700 µl af prøveblandingen fyldt på en spin-søjl-rørenhed og centrifugeret ved 14.000 x g i 1 minut.
3. Gennemgangen blev kasseret, og det foregående trin blev gentaget med den resterende prøveblanding.

Vi sørgede for, at hele prøveblandingen passerede ind i opsamlingsrøret ved at inspicere søjlen og centrifugerer igen ved 14.000 x g i 1 minut.

3. DNA'et blev vasket og elueret som følgende:

1. Spin-søjlen blev anbragt i et rent opsamlingsrør, 500 µl S5-WASH-puffer blev tilsat, og derefter blev spin-søjle-røret centrifugeret samling ved 14.000 x g i 1 minut.
2. Gennemgangen blev kasseret-, og derefter blev spin-søjle-røret centrifugeret samling ved 14.000 x g i 30 sekunder, vi gjorde den anden centrifugering for at optimere fjernelse af S5-WASH-puffer, der kunne forstyrre nedstrømsapplikationer.
3. Spin-søjlen blev anbragt i et rent rør, 100 ° S6-elueringsbuffer blev tilsat, og derefter blev rørene inkuberet ved stuetemperatur i 1 minut.
4. Spin-søjle-røret blev centrifugeret samling ved 14.000 x g i 1 minut, så blev søjlen kasseret.

Det oprensede DNA i røret blev anvendt til følgende nedstrøms applikationer.

1.5.2.PCR -amplifikation af 16S rRNA -genet

en. PCR -optimering

Umiddelbart efter DNA-ekstraktion blev PCR udført for at amplificere hypervariable regioner V3-V4 af 16S rRNA-gen ved anvendelse af følgende primere med Illumina-adaptere (understreget):

Fremadrettet primer 5'tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagAgAgCctACGGGGGGCWGCAG3 'omvendt primer 5'GTCTCGTGGGCGGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC 3' PCR -reaktioner blev udført til forberedelse 16Srrna til sekventering i 25μs reaktion med 0,8 Primere (10μM, Metabion, Tyskland), 3 μl skabelon -DNA og 12,5 μl 1 × Hot Master Mix (Genedirex PCR Supermix). 1.5.3. Agarosegelelektroforese Alle PCR -amplikoner blev vurderet ved at indlæse 5 μL af PCR -produktet i brønde på 1% (vægt/volumen) agarose. Fem μl hyperstige L -markør blev fyldt i den første brønd. Fem μl af PCR -reaktionsblandingen fra hver prøve blev indsat i de passende brønde af gelen. Gelen blev derefter nedsænket i Tris-Borate-EDTA (TBE) -bufferen og elektroforeret ved 90 V til adskillelse af fragmenterne. Gelen blev visualiseret efter excitation under UV -transillumination. De amplificerede produkter blev sendt til IGA Technology Services (Udine, Italien) for yderligere behandling.

1.5.4. PCR-produktoprensning (PCR-oprydning) Fem μL af PCR-reaktionsblandingen fra hver prøve blev blandet med 2 μl belastningsbuffer, og derefter blev PCR-produkter oprenset under anvendelse af Agincourt XP Ampure-perler (Beckam Coulter).

1.5.5. PCR -produktsekventering efter ampliconoprensning, dobbeltindekser og Illumina -sekventeringsadaptere blev fastgjort ved hjælp af Nextera XT -indekssættet (Illumina). Kvaliteten af ​​de endelige produkter blev vurderet ved anvendelse af en bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA), og efter deres kvantificering med en qubit (Invitrogen) blev prøverne samlet i lige store proportioner og sekventeret parret ende i en Illumina Miseq med 600 cykler (300 cycles for hver parret læst og 12 cycles til barcode-sekvensen) ved åa-teknologi-tjenester (UD (300, ental.

1.6. Sekvensanalyse 1.6.1. Sekvensanalyse med Illumina Miseq Metagenomics Workflow

IGA Technology Services udførte sekvensanalyse ved hjælp af Metagenomics Workflow of Miseq Reporter v2.3 (Illumina). Kort fortalt blev sekvenser demultiplexet baseret på indekssekvenser. FASTQ-filer blev genereret med et kvalitets score trim-prøvesæt for at lave trimning. Klassificeringstrinnet blev udført ved hjælp af Classify Reads, en proprietær Illumina-algoritme, der giver en klassificering på artsniveau for parrede ende-læsninger. Processen involverer matchende korte efterfølgende af læsninger (ord) til et sæt på 16S -referencesekvenser. Det akkumulerede ord matches for hver læsning blev brugt til at tildele læsninger til en bestemt taksonomisk klassificering. Taxonomipragasen for Metagenomics Workflow var en Illumina-kurateret version af GreenGenes-databasen (GreenGenes. Secondgenome. com/downloads/database/13_5).

1.6.2. Sekvensforarbejdning og analyse Illumina-platform genererede to læsninger for den fremadgående og omvendte retning af V3-V4-hyper-variabelt region af 16S rRNA-genet. Sekvensfiltrering og analyse af sekvensdata blev i det væsentlige udført med Mothur (v. 1.35.1) Softwarepakke (Schloss et al., 2009).

1.6.3. Datakombination og forarbejdning For det første blev frem- og omvendt læsning for hver prøve kombineret i en enkelt contig separat, og prøver fra hvert sted blev kombineret i et enkelt datasæt for hvert sted. Dette blev udført ved hjælp af (kommandoer. Contigs, Make. fil og lav. gruppe) henholdsvis.

1.6.4. Kontrol af kvalitetsværdi og filtrering

Kvalitetsfiltrering omfattede afvisning af læsninger <420NT og> 470 nt, eksklusive homopolymerkørsler> 8nt og 0 tvetydige baser, og kræver minimum gennemsnitlig phred -kvalitet ≥25 ved hjælp af (kommando trim. seqs).

Illumina genererer muligvis mange kopier af den samme sekvens, som blev betragtet som duplikerede sekvenser. Fordi det er beregningsmæssigt spildt at tilpasse den samme ting en bazillion tid, unikke vores sekvenser ved hjælp af (kommandoen unik.seqs).

1.6.5. Sekvensjustering til en referencedatabase Silva-database blev tilpasset til V3-V4-regionen på 16S rRNA-gen ved anvendelse af (kommandoen Pcr.Seqs), svarende til de samme regioner i Escherichia coli, der starter fra 6426 og slutter ved 27645. Derefter blev vores sekvenser tilpasset referencedatabasens referencesekvenser (http://www.arb-silva.de/) ved hjælp af (kommando align.seqs). (Quast et al., 2012)

1.6.6. Sekvensdeduplikation, denoising og kimærfjernelsesduplikatsekvenser blev fusioneret med tidligere unikke sekvenser ved at køre (kommando unik.seqs). For at denoise vores sekvenser blev prækluster sekvenserne udført ved hjælp af (kommandoen pre. klynge) muliggør op til 2 forskelle mellem sekvenser. Denne kommando delte sekvenserne efter gruppe og sorterede dem derefter efter overflod og gik fra mest rigelige til mindst og identificerede sekvenser, der var inden for 2 nt fra hinanden.

Chimeras -sekvenser blev fjernet under anvendelse af Mothur -implementeringen af ​​Uchime -algoritmen (Edgar et al., 2011). (Kommandokimera. Chime) detekteret kimærsekvens, som blev fjernet med (kommando get.seqs).

1.6.7. Sekvensklassificeringssekvenser blev justeret til Silva -taksonomien ved hjælp af en Bayesian -klassifikator med (kommandoklassificeringen.seqs). (Wang et al., 2007).

1.7 Bakteriel mangfoldighedsanalyse ved anvendelse af Qiime2 1.7.1 Alfa -mangfoldighedsanalyse Diversitetsanalytisk plugin inden for Qiime2 bruger en tilfældig resampling af 32.084 sekvenser pr. Prøve til jævn samplingdybde. Estimater af økologiske indekser inkluderede: Rarefaction -kurver, antallet af observerede OTU'er (arter) og Shannon -indekset, der repræsenterer almindelige mål for alfa -mangfoldighed. Rarefaction af alfa -mangfoldigheden, der definerede antallet af OTU'er, der blev påvist som en funktion af prøveudtagningsindsats, blev udført for at bekræfte, at prøveudtagningsdybde gav tilstrækkelig dækning til nøjagtigt at analysere de dominerende medlemmer af bakteriesamfund. Alfa -mangfoldighed blev analyseret ved anvendelse af to tilgange; Antallet af observerede arter, der repræsenterer rigdom og Shannon Diversity Index, der repræsenterer rigdom og jævnhed i lokalsamfundene.

1.7.2 Beta -mangfoldighedsanalyse Beta -mangfoldighedsanalyser blev estimeret til at bestemme fylogenetiske afstande mellem samfund, herunder vægtede UNIFRAC -afstandsmatrixer (Lozupone et al., 2011).

I den vægtede UNIFRAC -analyse tælles den relative overflod af taxa, der findes i prøven, så mindre rigelige OTU har mindre vægt i analysen.

UNIFRAC -hovedkoordinateranalyse (PCOA) blev udført til fortolkning af UNIFRAC -afstandsmatrixen. Phyloseq og GGPuBR, R -pakker blev anvendt til beregning og planlægning af α og ß -mangfoldighed (McMurdie og Holmes., 2013). Endelig blev signifikansforsøg af prøveklyngering vurderet ved permutational multivariat variansanalyse (Adonis R, Package Vegan) (Anderson., 2001) Brug af den vægtede UNIFRAC -afstandsmatrix i Qiime af Compare_Category.py manuskript.

1.8. Kerne -mikrobiomanalyse: At opdage et kerne -mikrobiom er meget vigtigt for at forstå de stabile, konsistente elementer på tværs af komplekse mikrobiske samlinger. En kerne defineres ofte som pakken af ​​medlemmer, der deles mellem mikrobielle konsortier fra lignende levesteder og er repræsenteret af de overlappende områder af cirkler i Venn -diagrammer, hvor hver cirkel indeholder medlemskab af prøven eller levesteder, der sammenlignes (Shade and Handelsman., 2012).

1.9. Identifikation af biomarkører og diskriminerende taxa lefse eksemplificerer den lineære diskriminerende analyse (LDA) effektstørrelsesmetode. Lefse er en algoritme til højdimensionel biomarkøridentifikation og karakterisering, der identificerer funktioner såsom gener, veje eller taxa, der forklarer forskellene mellem to eller flere biologiske tilstande. Ideen om Lefse er at begynde at definere signifikant differentielt rigelige OTU'er, derefter bruge Wilcoxon Rank Sum -testen til at kontrollere for konsistens i den differentielle overflod og til sidst estimere en effektstørrelse pr. Funktion ved hjælp af lineær diskriminerende analyse. Denne metode antager, at mikrobielle samfund kan adskilles ved en lineær kombination af OTU'er (Segata et al., 2011).

1.10. Korrelation mellem samfundsmedlem Spearmans rangkorrelationskoefficient bruges til at opdage styrken af ​​en forbindelse mellem to datasæt. Korrelationskoefficienten har en maksimal værdi på 1, hvilket indikerer en perfekt positiv sammenhæng mellem datasættene og en minimumsværdi på -1, hvilket indikerer en perfekt negativ sammenhæng mellem datasæt. En værdi på 0 angiver ingen sammenhæng mellem rækkerne for de observerede værdier (Farlie., 1960).