Impatto di farmaci antivirali ad azione diretta sugli schemi del microbiota intestinale in pazienti con malattie epatiche croniche correlate all'HCV

È uno studio caso-controllo che è stato condotto su 8 pazienti con infezione cronica non cirrhotica con virus dell'epatite C (gruppo I), 4 pazienti trattati con successo da HCV dopo aver ricevuto 12 settimane di DAA (Sofosbuvir, Daclatasvir) che hanno raggiunto una risposta virale prolungata (gruppo II) e 4 pazienti che hanno infilato dopo 12 settimane di DAA (Sofosbuvir/Velpatasvir/Voxilaprevir) (Gruppo III). Quattordici soggetti di controllo sano abbinato per età e sesso (gruppo VI) sono stati iscritti dopo aver ottenuto il loro consenso informato. Sono stati determinati prese di storia dettagliata, esame clinico, ultrasuoni addominali (U/S) e indagini di laboratorio tra cui emocromo completo (CBC), test di funzionalità epatica e transaminasi sieriche per tutti i pazienti.

Inclusion criteria: patients of any age or sex who was proved to be infected with hepatitis C virus without treatment, those who received treatment and sustained viral response and those who received treatment and relapsed and healthy controls were enrolled in the study Exclusion Criteria Patients receiving antibiotic treatment, probiotics, or any other medical treatment influencing intestinal microbiota 1 month before the start of the study as well as patients with any other viral infection as HBV, e l'HIV è stato escluso.

Collezione di campioni campioni di feci fresche sono stati raccolti al mattino da tutti i partecipanti e sono stati elaborati entro 1 ora dopo la defecazione. È stata utilizzata una tecnica asettica per la raccolta di tutti i campioni, con cura per evitare la contaminazione.

Inoltre, 5 ml di sangue venoso in condizioni asettiche sono stati raccolti da ciascun paziente per la stima dei diversi parametri di laboratorio.

1.4: La valutazione quantitativa del livello di HCV-RNA di carico virale dell'RNA è stata rilevata utilizzando la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) (Bioline International, Regno Unito) con un limite inferiore di rilevazione di 15 UI/mL. (Alter., 2007).

1.5: profilazione di microbiota 1.5.1.dna estrazione

Immediatamente dopo la raccolta, il DNA genomico è stato estratto dai campioni di feci usando il kit di purificazione del DNA di microbioma PureLink Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Cat #A29790). I campioni di feci sono stati miscelati accuratamente per creare un campione omogeneo prima di pesare e trasferire la quantità misurata delle feci (0,2 ± 0,05 g) al tubo di perline, quindi abbiamo seguito le istruzioni come indicato dal produttore come segue:

Abbiamo eseguito la procedura a temperatura ambiente (20-25 ºC) .1. Il lisato è stato preparato come segue:

1. Il campione (0,2 ± 0,05 g) e il tampone S1-Lysis (600 µl) sono stati aggiunti al tubo di perline, la miscela totale era di 800 µl,
2. I tubi di perline sono stati vortici per garantire che i campioni fossero completamente dispersi nel liquido.
3. Sono stati aggiunti e vortice un cento µl di potenziatore di S2 -lysis.

e. I tubi di perline sono stati vortici per 10 minuti alla massima velocità sul mixer vortice usando adattatore a mani libere e agitazione orizzontale.

F. I tubi di perline sono stati centrifugati a 14.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.

G. Quindi, 400 µl del surnatante sono stati trasferiti in una provetta per microcentrifuga pulita.

H. Successivamente, 250 µl di tampone di pulizia S3 sono stati aggiunti ai tubi e vortici immediatamente per garantire una dispersione uniforme di S3 e precipitazione uniforme degli inibitori.

io. I tubi di perline sono stati centrifugati a 14.000 × g per 2 minuti a temperatura ambiente.

J. Quindi 500 µl del surnatante sono stati trasferiti in una provetta per microcentrifuga pulita, con cura per evitare il pellet e qualsiasi detrito.

2. Quindi, il DNA era legato alla colonna come segue:

1. Un totale di 900 µl di tampone di legame S4 ​​è stato aggiunto ai tubi e vortici brevemente.
2. Quindi, 700 µl della miscela del campione sono stati caricati su un gruppo tubo colonnello di spin e centrifugati a 14.000 × g per 1 minuto.
3. Il flusso-through è stato scartato e il passaggio precedente è stato ripetuto con la miscela di campionamento rimanente.

Abbiamo assicurato che l'intera miscela di campionamento passasse nel tubo di raccolta ispezionando la colonna e centrifugando di nuovo a 14.000 × g per 1 minuto.

3. Il DNA è stato lavato ed eluito come segue:

1. La colonna di spin è stata posizionata in un tubo di raccolta pulito, sono stati aggiunti 500 µl di tampone S5-Wash, quindi il tubo di colonna di spin è stato un gruppo centrifugato a 14.000 × g per 1 minuto.
2. Il flusso-through è stato scartato- e quindi il tubo di colonna di spin è stato centrifugato a 14.000 × g per 30 secondi, abbiamo fatto la seconda centrifugazione per ottimizzare la rimozione del tampone S5-Wash che potrebbe interferire con le applicazioni a valle.
3. La colonna di spin è stata posizionata in un tubo pulito, sono stati aggiunti 100 µl di tampone di eluizione S6, quindi i tubi sono stati incubati a temperatura ambiente per 1 minuto.
4. Il tubo di colonna di spin è stato centrifugato Assembly a 14.000 × g per 1 minuto, quindi la colonna è stata scartata.

Il DNA purificato nel tubo è stato utilizzato per le seguenti applicazioni a valle.

1.5.2.pcr amplificazione del gene rRNA 16S

UN. Ottimizzazione della PCR

Immediatamente dopo l'estrazione del DNA, è stata condotta PCR per amplificare le regioni iper variabili V3-V4 del gene rRNA 16S usando i seguenti primer con adattatori Illumina (sottolineati):

Forward Primer 5'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG3' Reverse Primer 5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC 3' PCR reactions were performed for preparing 16SrRNA for sequencing in 25μL reactions with 0.8μL for each forward and Primer inversi (10 μm, Metabion, Germania), 3 μL di DNA modello e 12,5 μL di 1 × di mix di master hot (Supermix PCR di GeneDirex). 1.5.3. Elettroforesi su gel di agarosio Tutti gli ampliconi PCR sono stati valutati caricando 5 μL del prodotto PCR in pozzi di agarosio all'1% (p/v). Cinque μL di marcatore L Hyper Ladder sono stati caricati nel primo pozzo. Cinque μL della miscela di reazione PCR di ciascun campione sono stati inseriti nei pozzi appropriati del gel. Il gel è stato quindi immerso nel tampone Tris-borato-EDTA (TBE) ed elettroforizzato a 90 V per la separazione dei frammenti. Il gel è stato visualizzato dopo l'eccitazione sotto transilluminazione UV. I prodotti amplificati sono stati inviati a IGA Technology Services (Udine, Italia) per ulteriori elaborazioni.

1.5.4. Purificazione del prodotto PCR (pulizia della PCR) Cinque μL della miscela di reazione PCR da ciascun campione sono stati miscelati con 2 μL di tampone di carico e dopo che i prodotti PCR sono stati purificati usando le perle Agincourt XP Ampure (Beckam Coulter).

1.5.5. Il sequenziamento del prodotto PCR dopo la purificazione di amplicon, gli adattatori di sequenziamento a doppio indici e Illumina sono stati collegati utilizzando il kit di indice Nextera XT (Illumina). The quality of the final products was assessed using a Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA) and, after their quantification with a Qubit (Invitrogen), the samples were pooled in equal proportions and sequenced paired-end in an Illumina MiSeq with 600 cycles (300 cycles for each paired read and 12 cycles for the barcode sequence) at IGA Technology Services (Udine, Italy).

1.6. Analisi della sequenza 1.6.1. Analisi di sequenza con il flusso di lavoro di metagenomica Illumina Miiseq

IgA Technology Services ha eseguito l'analisi delle sequenze utilizzando il flusso di lavoro Metagenomics di Miseq Reporter V2.3 (Illumina). In breve, le sequenze sono state demultiplesse in base alle sequenze di indici. I file FASTQ sono stati generati con un set di fogli campioni di punteggio di qualità, per fare il taglio. La fase di classificazione è stata eseguita utilizzando Classify Reads, un algoritmo di Illumina proprietario che fornisce una classificazione a livello di specie per letture di fascia abbinata. Il processo prevede la corrispondenza di brevi successioni delle letture (parole) a un insieme di sequenze di riferimento 16S. Le corrispondenze di parole accumulate per ogni lettura sono state utilizzate per assegnare letture a una particolare classificazione tassonomica. Il database della tassonomia per il flusso di lavoro metagenomics era una versione curata da illumina del database Greengenes (GreenGenes. Secondenome. com/downloads/database/13_5).

1.6.2. La preelaborazione della sequenza e la piattaforma di analisi Illumina hanno generato due letture per la direzione in avanti e inversa della regione iper-variabile V3-V4 del gene rRNA 16S. Il filtraggio di sequenza e l'analisi dei dati di sequenza sono stati essenzialmente eseguiti con Mothur (V. 1.35.1) Pacchetto software (Schloss et al., 2009).

1.6.3. La combinazione di dati e la preelaborazione in primo luogo, le letture in avanti e inversa per ciascun campione sono state combinate in un singolo contig separatamente e i campioni di ciascun sito sono stati combinati in un singolo set di dati per ciascun sito. Questo è stato eseguito usando il (comandi. Contigs, make. file e crea. gruppo) rispettivamente.

1.6.4. Controllo e filtraggio del valore di qualità

Il filtraggio di qualità includeva letture di rifiuto <420nt e> 470 NT, escluse le corse di omopolimero> 8nt e 0 basi ambigue e che richiedono una qualità media minima di Phred ≥25 utilizzando (trim di comando. seq).

Illumina può generare molte copie della stessa sequenza che sono state considerate sequenze duplicate. Poiché è computazionalmente dispendioso per allineare la stessa cosa che un Bazillion Times, abbiamo unici le nostre sequenze usando (comandi univoci.seq).

1.6.5. L'allineamento della sequenza a un database SILVA del database di riferimento è stata personalizzata nella regione V3-V4 del gene rRNA 16S usando il (comando pcr.seqs), corrispondente alle stesse regioni di Escherichia coli a partire da 6426 e terminando a 27645. Successivamente, le nostre sequenze sono state allineate alle sequenze di riferimento del database di riferimento (http://www.arb-silva.de/) Utilizzo (comando align.seqs). (Quast et al., 2012)

1.6.6. La deduplicazione della sequenza, la denoising e le sequenze duplicate di rimozione della chimera sono state unite con le sequenze univoci precedenti (comando unici.seqs). Per denoire le nostre sequenze, precluse le sequenze sono state eseguite usando (comando pre. Cluster) consentendo fino a 2 differenze tra sequenze. Questo comando ha diviso le sequenze per gruppo e poi le ha risolte per abbondanza e è passato dalle sequenze più abbondanti a quelle meno e identificate che si trovavano entro 2 nt l'una dall'altra.

Le sequenze di chimere sono state rimosse utilizzando l'implementazione di Mothur dell'algoritmo UChime (Edgar et al., 2011). La (comando chimera. CHIME) ha rilevato la sequenza chimerica che è stata rimossa da (comando get.seqs).

1.6.7. Le sequenze di classificazione della sequenza sono state allineate alla tassonomia Silva usando un classificatore bayesiano con (comandi Classify.seqs). (Wang et al., 2007).

1.7 Analisi della diversità batterica mediante Qiime2 1.7.1 Analisi della diversità alfa Il plug -in analitico di diversità all'interno di Qiime2 utilizza un ricampionamento casuale di 32.084 sequenze per campione per una profondità uniforme del campionamento. Le stime degli indici ecologici includevano: curve di rarefazione, numero di OTU osservate (specie) e l'indice di Shannon, che rappresentano misure comuni della diversità alfa. La rarefazione della diversità alfa, che definisce il numero di OTU rilevati in funzione dello sforzo di campionamento, è stata eseguita per confermare che la profondità di campionamento ha dato una copertura sufficiente per analizzare accuratamente i membri dominanti delle comunità batteriche. La diversità alfa è stata analizzata usando due approcci; Il numero di specie osservate che rappresentano la ricchezza e l'indice di diversità di Shannon che rappresentano la ricchezza e la uniformità delle comunità.

1.7.2 Analisi della diversità beta Le analisi della diversità beta sono state stimate per determinare le distanze filogenetiche tra comunità tra cui matrici di distanza unifrac ponderate (Lozupone et al., 2011).

Nell'analisi UNIFRAC ponderata, viene conteggiata l'abbondanza relativa di taxa presenti nel campione, quindi OTU meno abbondante ha meno peso nell'analisi.

L'analisi delle coordinate principali UniFrac (PCOA) è stata eseguita per l'interpretazione della matrice di distanza UniFrac. I pacchetti di Phyloseq e GGPUBR, R sono stati utilizzati per il calcolo e la trama della diversità α e β (McMurdie e Holmes., 2013). Infine, il test di significatività del clustering campione è stato valutato mediante analisi multivariata permutazionale della varianza (Adonis R, Package Vegan) (Anderson., 2001) Utilizzando la matrice di distanza unifrac ponderata in qiime da compare_categories.py sceneggiatura.

1.8. Analisi del microbioma core: scoprire un microbioma di base è molto importante per comprendere gli elementi stabili e coerenti attraverso assemblaggi microbici complessi. Un nucleo è spesso definito come la suite di membri condivisi tra consorzi microbici da habitat simili ed è rappresentata dalle aree sovrapposte dei circoli nei diagrammi di Venn, in cui ogni cerchio contiene l'adesione al campione o agli habitat che vengono confrontati (Shade and Handelsman., 2012).

1.9. L'identificazione di biomarcatori e taxa discriminatori Esemplifica il metodo di dimensione dell'effetto di analisi discriminante lineare (LDA). LefSE è un algoritmo per l'identificazione e la caratterizzazione del biomarcatore ad alta dimensione che identifica caratteristiche come geni, percorsi o taxa che spiegano le differenze tra due o più stati biologici. L'idea di LEFSE è quella di iniziare a definire OTU significativamente differenzialmente abbondanti, quindi utilizzare il test di somma di rango di Wilcoxon per verificare la coerenza nell'abbondanza differenziale e infine stimare una dimensione dell'effetto per funzionalità utilizzando l'analisi discriminante lineare. Questo metodo presuppone che le comunità microbiche possano essere separate da una combinazione lineare di OTUS (Segata et al., 2011).

1.10. Correlazione tra il membro della comunità Il coefficiente di correlazione del rango di Spearman viene utilizzata per scoprire la forza di un legame tra due serie di dati. Il coefficiente di correlazione ha un valore massimo di 1, indicando una perfetta associazione positiva tra i set di dati e un valore minimo di -1 che indica un'associazione negativa perfetta tra i set di dati. Un valore di 0 indica nessuna associazione tra i ranghi per i valori osservati (Farlie., 1960).