Phänotypisierung des Adenokarzinoms des Dünndarms (BIONADEGE)

Die NADEGE-Kohorte umfasst 75 Zentren und hatte 365 Patienten aufgenommen. Darunter hatten 232 Patienten in 58 Zentren eine Resektion des Primärtumors. Dies wird die weltweit größte Serie von SBA für biologische Studien sein. Die in die NADEGE-Kohorte aufgenommenen Patienten waren sich der biologischen Studie bewusst und ihre Genehmigung zur Durchführung wurde bereits eingeholt.

Klinische Ausgangsdaten von Patienten, die in die NADEGE-Kohorte aufgenommen wurden, sind bereits verfügbar und wurden in einer Posterdiskussionssitzung auf dem Kongress der European Society for Medical Oncology 2013 vorgestellt. In der gesamten Kohorte war die primäre Lokalisation bei 51 % der Patienten das Duodenum, und eine prädisponierende Erkrankung wurde bei 18,8 % der Patienten berichtet, hauptsächlich Morbus Crohn bei 8 % und Lynch-Syndrom bei 6 % der Patienten. Die Nachverfolgung läuft. Die Analyse des 3-jährigen rezidivfreien Überlebens ist für 2015 und die Analyse des 5-jährigen Gesamtüberlebens für 2017 geplant.

Heute werden 187 Tumorproben in der Pathologieabteilung des Krankenhauses Saint Antoine (Paris) gesammelt und archiviert. Unter diesen 187 Tumoren sind die Tumorstadien: Stadium 0: 4, Stadium I: 10, Stadium II: 34, Stadium III: 63, unbestimmtes Stadium, nicht metastasierend: 30 (also 141 nicht metastasierende Tumore) und Stadium IV: 48, und die primären sind: Duodenum: 128, Jejunum: 31, Ileon: 27, unbestimmt: 3. Die durchgeführte Chemotherapie war FOLFOX in 80 % der Fälle.

Arbeitspaket 1: Datenbank (Team 1) Die klinischen Daten der NADEGE-Kohorte werden mit einem e-crf erhoben. Die ersten beschreibenden Daten werden bereits vom GERCOR-Team überwacht. Die Ergebnisse wurden bereits präsentiert. BIONADEGE ist eine geplante Begleitstudie zur NADEGE-Kohorte. Die ergänzenden Anfragen im Sinne von BIONADEGE werden vom Team 1 an den NADEGE-Untersucher gerichtet. Die Nachsorgedaten für Progression (Metastasenpatienten), Rezidiv (Nicht-Metastasenpatienten) und Tod (alle Patienten) werden alle 6 Monate erhoben. Follow-up-Daten werden bis 2019 erhoben, um eine 5-Jahres-Follow-up für alle Patienten zu erhalten.

Arbeitspaket 2: Anatomopathologie (Team 2) Alle Tumorproben befinden sich bereits im Pathologielabor des Krankenhauses Saint Antoine. Objektträger aus einem repräsentativen Tumorbereich werden ausgewählt und an die Pariser Descartes-Universität geschickt, um die DNA-Extraktion zu ermöglichen. Tissue Microarrays (TMA) für immunhistochemische Validierungsstudien werden durchgeführt. Mehrere potenzielle prognostische Marker werden als MismatchRepair (MMR)-Protein, P53, Beta-Catenin, c-myc-Protein bewertet. Weitere prädiktive Marker für Chemotherapie sind hENT1, O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) und für zielgerichtete Therapien Proto-Onkogen-Tyrosin-Proteinkinase (ROS1), Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor c-Met (HGFR), Alk, Human Epidermal Growth Factor Receptor -2 (HER-2) und programmierter Zelltod 1 (PD-1) werden ebenfalls bewertet. Die Fälle, in denen HER-2 und HGFR-Protein durch Immunhistochemie überexprimiert werden, werden durch fluoreszierende In-situ-Hybridisierung (FISH) getestet.

Arbeitspaket 3: Biochemie (Team 3) DNA wird aus Tumorblock in der Universitätseinheit S1147 gemäß dem folgenden Protokoll extrahiert. Unter Verwendung einer 1,0-mm-Stanze werden in Paraffin eingebettete Gewebe aus allen Fällen aus repräsentativen Bereichen entnommen, die mehr als 50 % der Tumorzellen enthalten. Anschließend wird aus jeder Probe gemäß den Empfehlungen des Herstellers DNA extrahiert. Das Team3 wird eine konkurrenzfähige allelspezifische Taqman-Sonde verwenden, die auf dem Kras-Wildtyp-Allel (Hs.00000174-rf – Life Technologies) bei serieller Verdünnung jeder DNA-Probe entwickelt wurde, um amplifizierbare DNA zu quantifizieren. Nur Proben mit mehr als 10 ng amplifizierbarer DNA werden für die Sequenzierung zurückbehalten. DNA aus jeder Probe wird amplifiziert. Das Vorhandensein von mehr als 740 somatischen Hot-Spot-Mutationen in den 46 Genen wird untersucht. Die Datenanalyse, einschließlich des Abgleichs mit dem menschlichen hg19-Referenzgenom und des Varianten-Calling, erfolgt mit der Software von Life Technologies. Alignments werden visuell verifiziert und mit der Software von Integrative Biosoftware kommentiert. Eine Sequenzvariation wird als potenzielle Mutation betrachtet, wenn (i) die Abdeckung größer als 200x ist, (ii) die Allelhäufigkeit größer als 10 % ist, (iii) die Strangverzerrung zwischen 0,2 und 0,8 liegt, (iv) die Variation wird nicht in der 1000-Genome-Datenbank gemeldet, (v) die Variation ist eine Missense- oder Nonsense-Variation. Alle diese ausgewählten Variationen werden unter Verwendung der Sanger-Sequenzierungstechnik unter Verwendung von amplifizierten Fragmenten von weniger als 150 bp, zentriert auf die potentielle Mutation, kontrolliert.