Andromeda-tutkimus. Yhdistettyjen kriteerien ennakoiva arvo räätälöimään rintasyövän seulontaa.

Rintasyöpä (BC) on yleisin kasvain naisilla maailmanlaajuisesti. Italiassa noin yksi kolmesta naisten pahanlaatuisesta syövästä (29 %) on BC (pois lukien ihokasvaimet), kuten Italian syöpärekisterit raportoivat vuosina 2006–2009. Tulokset satunnaistetuista kokeista, jotka on tiivistetty Nelsonin et al.:n päivitetyssä katsauksessa ja meta-analyysissä U.S. Preventive Task Forcelle, osoittivat, että mammografiaseulontaohjelmaan osallistuminen vähentää BC-kuolleisuutta 14-32 % ikähaarukasta riippuen. Italiassa varhaisen diagnoosin mammografiaseulonta on toteutettu alueellisesti useilla Italian alueilla. Kansallisten ja kansainvälisten ohjeiden mukaisesti useimmat ohjelmat kutsuvat 50–69-vuotiaat naiset mammografiaan kahden vuoden välein.

Vaikka mammografiasta on tullut standardi BC-seulonnassa, sen rajoitukset tunnetaan hyvin (ylidiagnoosi, ionisoivan säteilyn käyttö, huono tarkkuus naisilla, joilla on tiheä rintakudos, suhteellisen korkea väärien positiivisten tulosten määrä ja henkilökohtainen epämukavuus). Lisäksi nykyiset seulontaprotokollat ​​perustuvat vain naisen ikään jättäen huomiotta muut riskitekijät ja määrittelevät yksittäisen seulontajakson ennalta määritellyn ikäryhmän sisällä.

Tämänhetkisiä haasteita BC:n hallinnassa ovat herkkien ja spesifisten vähän invasiivisten biomarkkereiden etsiminen, jotka liittyvät varhaisiin neoplastisiin muutoksiin. Useita kiertäviä kasvainmarkkereita (kuten karsinoalkion antigeeni, CEA tai hiilihydraattiantigeeni 15-3, CA 15-3) käytetään laajalti BC-käsittelyssä, mutta niiden herkkyys on hyvin alhainen. MikroRNA:t (miRNA:t) ovat pieniä, ei-koodaavia RNA:ita (noin 18-25 nukleotidia pitkiä), jotka säätelevät geenien ilmentymistä solujen sisällä hajottamalla mRNA:ta tai estämällä proteiinisynteesiä. Koska heillä voi olla satoja kohteita, ne pystyvät hallitsemaan useita solujen sisällä olevia biologisia prosesseja. On olemassa kasvavaa näyttöä siitä, että miRNA:ita voi vapautua myös solujen ulkopuolelle, ja kasvaimen ja sen mikroympäristön vapauttamien miRNA:iden lisääntyneitä määriä sekä fysiologisen verenkierron miRNA-tasojen laskua on jo havaittu syöpäpotilaiden seerumissa/plasmassa. Tällaisten molekyylien mahdollista käyttöä diagnostisiin/prognostisiin tarkoituksiin rintasyövän osalta on arvioitu laajasti, ja niiden stabiilisuus kehon nesteissä on avannut uusia mahdollisuuksia BC-diagnoosin ennakointiin, minimaalisesti invasiivisilla interventioilla erityisesti naisille, joilla on suurempi riski.

Hypoteesi: Riskipohjaiset seulontaohjelmat erilaisten BC-riskikriteerien mukaan (esim. rintojen tiheys, mallipohjaiset arviot absoluuttisesta riskistä, elämäntavat) voivat maksimoida seulonnan vaikutuksen eri riskien omaavissa naisryhmissä. Tietojen kerääminen riskien kerrostamista varten väestöpohjaisissa seulontaohjelmissa vaatii suuria resursseja. Ei-riippumattomat kriteerit, jotka tunnistavat samat suuremmassa riskissä olevat naiset, ovat tarpeettomia, ja niitä olisi pidettävä toisensa poissulkevina. Validoidut erittäin tarkat veren molekyylibiomarkkerit, jotka liittyvät BC-riskiin, voivat olla täydentävä työkalu mammografialle ensisijaisessa seulontaympäristössä.

Tutkimuksen ensimmäinen tavoite on arvioida ja verrata suuressa naisjoukossa käytettävissä olevien kriteerien ennustearvoa BC-riskin määrittämiseksi, jotta voidaan tunnistaa sopivat riskiin perustuvat ositteet henkilökohtaista seulontaa varten. Harkittavat kriteerit ovat:

i. yleiset riskitekijät, jotka on kerätty standardoidulla riskikyselylomakkeella (esim. lisääntymistekijät, ensimmäisen asteen sukuhistoria, biopsiahistoria, fyysinen aktiivisuus, BMI ja alkoholinkäyttö). Tämän kategorian absoluuttinen riski arvioidaan käyttämällä Petraccin et al. joka on kehitetty Italian väestölle ja validoitu riippumattomalle italialaisnaisille.

ii. rintojen tiheys; iii.naisen elämäntavat (ruokavaliotapoja ja fyysistä aktiivisuutta koskevan yksityiskohtaisen kyselyn avulla).

Tutkimus on suunniteltu saavuttamaan seuraavat ensimmäiseen tavoitteeseen liittyvät toissijaiset tavoitteet:

Ikä- ja riskikohtaisten seulontatulosten mittaamiseen (esim. havaitsemisnopeus, palautusnopeus ja hyvänlaatuisten/pahanlaatuisten kirurgisten biopsioiden suhde).

kvantifioida räätälöityjen seulonnan mahdollisten interventioiden vaikutus terveystuloksiin ja kustannuksiin tietämällä riskitekijöiden jakautumisesta kohdeväestössä; Arvioida mahdollisen räätälöidyn toimenpiteen taloudellista ja organisatorista toteutettavuutta ja suunnitella ositettuja rintasyövän seulontastrategioita tulevaa pilottiseulontaohjelman täytäntöönpanoa varten; Seurannan jatkaminen hankkeen kolmen vuoden keston yli antaa meille mahdollisuuden määrittää entistä johdonmukaisempia arvioita edellä mainituista ennustearvoista ja arvioida tässä tutkimuksessa huomioituja kriteerejä/riskitekijöitä monimuuttuja-analyyseissä.

Toinen päätavoite on tutkia, muuttuvatko valikoidut verenkierrossa aiemmin BC-riskiin liittyvät miRNA:t merkittävästi syöpäpotilaiden plasmassa verrattuna vastaaviin terveisiin verrokkeihin ja täyttävätkö ne ennalta määritellyt tosi- ja väärät positiiviset määrät, joita pidetään minimaalisesti hyväksyttävinä. seulonta-asetuksissa.

Asiaan liittyvät alatavoitteet:

• arvioida tekijöiden, kuten iän, rintojen tiheyden, lisääntymistekijöiden ja sukuhistorian sekä elämäntapojen ja miRNA-tason välistä yhteyttä syövästä vapaassa populaatiossa. Jos tällaiset tekijät vaikuttavat biomarkkeriin, seulontapositiivisuuden kynnys on ehkä määriteltävä erikseen alapopulaatioille, jotta väärien positiivisten tulosten määrä pysyy alhaisella tasolla jokaisessa. - Arvioida miRNA-tasoon liittyviä tekijöitä syöpätapauksissa - erityisesti sairauden ominaisuuksia, kuten vaihetta, astetta ja saatavilla olevia prognostisia tekijöitä. Biomarkkerilla havaitun syövän luonteen ymmärtäminen on avainkysymys. Biomarkkeri, joka havaitsee syövän varhaisessa vaiheessa, on ennaltaehkäisevästi arvokkaampi kuin se, joka havaitsee vain myöhäisvaiheen syövät.
• arvioida 18 tällä hetkellä vakiintuneen rintasyöpäriskin SNP:n läsnäoloa, jotka on saatu genominlaajuisilla assosiaatiotutkimuksilla (GWAS), jotka ovat tunnistaneet yleisiä matalan penetranssin alleeleja, jotka liittyvät rintasyöpäriskiin useissa geneettisissä lokuksissa, ja testata niiden yhteyttä kiertäviin miRNA:ihin, rintojen tiheyteen ja seulomiseen tulokset.

Vaihe 1 – Ilmoittautuminen Noin 36 600 naiselle (ikähaarukka: 46–67 vuotta), jotka osallistuvat BC-seulontaohjelmaan valituilla alueilla, tarjotaan osallistumista Andromeda-tutkimukseen. Heistä 22 000:n odotetaan antavan tietoisen suostumuksen. Ilmoittautumisen yhteydessä kerätään tiedot BC-riskitekijöistä ja elämäntavoista sekä rintojen tiheys ja verinäytteitä seerumin, plasman ja buffy coatin varastointia varten.

Naisia, jotka suostuvat osallistumaan Andromedaan, pyydetään täyttämään kyselylomake BC-standardin riskinsä suunnittelemiseksi ja yksityiskohtainen kysely heidän elämäntavoistaan. Heitä pyydetään myös toimittamaan verinäyte.

Lisäksi rintojen tiheys lasketaan rintojen tutkimuksessa. Tutkimukset lukee kaksi asiantuntijaradiologia, ja rintojen tiheys luokitellaan luokkiin Breast Imaging Reporting and Data Systemin (BI-RADS) avulla.

Verinäytteitä ottavat naiset saavat erityisen ajan, jossa koulutettu henkilökunta kerää verenoton lisäksi antropometrisiä mittauksia ja tukee heitä tarvittaessa tutkimuksen kyselylomakkeiden täyttämisessä.

Koska positiivisuus tiheälle rinnolle, Gail-pisteet, elämäntapaan liittyvä riski ja miRNA määritetään samoilla koehenkilöillä, annetaan tehokkain arvio suhteellisten (positiivisten vs. negatiivisten) positiivisten ennustearvojen (PPV) välisestä suhteesta kahdelle eri tekijälle. a x b/c x d, jossa a = syövän positiivinen tekijä 1, mutta ei tekijä 2; b = naiset, joilla on epänormaali mammografia mutta ei syöpää, positiivinen tekijä 2, mutta ei tekijä 1; c = syövät positiiviset tekijälle 2 - mutta ei tekijälle 1; d = naiset, joilla on epänormaali mammografia, mutta ei syöpää, positiivinen tekijälle 1, mutta ei tekijälle 2. Olettaen, että 40 prosentilla 21 000 osallistuneesta naisesta on tiheä rinta, 20 prosentilla tietty Gail-pistemäärä, 50 prosentilla elämäntapariski ja 20 prosentilla tietty. miRNA, että 11 % tutkittavista naisista kantaa rintasyöpää ja että mammografian kokonais-PPV on 20 %, noin 100-120 ristiriitaista syöpää ja 640-740 epäsopivaa naista, joilla on epänormaali mammografia, mutta ei syöpää, on odotettavissa tarkasteluissa tekijöissä. Näillä oletuksilla tutkimuksella on 80 %:n valta hylätä (alfa = 0,05) nollahypoteesi, jonka mukaan suhteellinen PPV-suhde on =1, jos sen todellinen arvo on vähintään 1,8-2,0, riippuen kahdesta huomioitu tekijästä.

Vaihe 2 – Biomarkkerianalyysi Andromeda-tutkimus sisältää molekyylianalyysit SNP:iden ja kiertävien miRNA:iden arvioimiseksi. Analyysit suoritetaan sokeasti asianmukaiselle tapauskontrollinäytteelle, joka on otettu tutkimukseen osallistuneiden naisten kohortista heti, kun BC-tapausten vähimmäismäärä on saavutettu. . Sokkouttaminen mahdollistaa sen, että kohteen tulostilan tieto ei vaikuta määritystuloksen tulkintaan tai varovaisuuteen, jolla näytettä käsitellään. Genominen DNA uutetaan buffy coatista High Pure PCR Template -valmistepakkauksella. 18 SNP:tä monistetaan PCR:llä ja arvioidaan qPCR-laitteella erityisillä määrityksillä. The 18 breast cancer risk related SNPs are: rs11249433, rs1045485, rs13387042, rs4973768, rs10941679, rs889312, rs2046210, rs13281615, rs1011970, rs2981582, rs2380205, rs10995190, rs704010, rs3817198, rs614367, rs999737, rs3803662 and rs6504950.

Kiertävän kokonais-RNA:n uuttaminen plasmanäytteistä suoritetaan miRNeasy-minikitillä Exiqon-protokollan mukaisesti, mikä tarkoittaa RNA-kantajan (batterifage MS2 RNA, Roche Diagnostics) käyttöä RNA:n saostumisen ja sen puhdistamisen edistämiseksi kalvoilla. Cel-miR-139:ää käytetään piikkien kontrollina uuttotuloksen tarkistamiseksi ja tietojen normalisoimiseksi yhdessä hasmiR-1228:n kanssa. RNA-näytteet eluoidaan nukleaasivapaalla vedellä ja säilytetään -80 °C:ssa. Hemolyysin tarkistamiseksi käytetään uutta menetelmää.

Biomarkkerien keskeiseen arviointiin tarvittavan otoskoon laskemiseksi (ilmaistuna jatkuvassa asteikossa) tyypillisten kiinnostuksen kohteiden suorituskykymittareiden, kuten tosipositiivisten prosenttiosuuksien (TPR) ja väärien positiivisten prosenttiosuuden, minimaalisesti hyväksyttävät ja toivottavat tasot ( FPR) on määritelty. Yleisessä väestöseulonnassa väärien positiivisten tulosten on oltava melko alhaisia, jotta vältytään valtavalta määrältä ihmisiä tarpeettomista kalliista lääketieteellisistä toimenpiteistä. Siten oletimme maksimaalisen hyväksyttävän väärien positiivisten osuuden (FPR0) 4 % (minimaalisesti hyväksyttävä spesifisyys on siis 96 %) ja minimaalisesti hyväksyttävän herkkyyden 80 % (TPR0). Hylättävä nollahypoteesi on seuraava: H0: TPR0≤0,80 tai FPR0≥0,04.

Vaadittu otoskoko 80 % teholla (alfa = 5 %) ja olettaen, että haluttu tosipositiivisten ja väärien positiivisten prosenttiosuudet ovat TPR1 = 0,90 ja FPR1 = 0,05, vastaavasti oli 179 tapausta ja 537 kontrollia. Otoskoon laskenta perustui teoreettisesti ROC-käyrään. Oletetaan, että vuotuinen BC-detektioprosentti (DR) on 0,006 ensimmäisenä vuonna ja 0,005 toisena tutkimusvuonna (siksi kaksivuotisluku oli 0,011), yhteensä 233 tapauspotilasta tutkimuksen kahden ensimmäisen vuoden aikana odotetaan noudatettava, mikä ylittää vaaditun 179 Nämä arviot perustuvat aiempina vuosina samoissa tässä tutkimuksessa käsitellyissä keskuksissa havaittuihin DR-arvoihin. Siten molekyylianalyysit suoritetaan 233 tapaukselle ja 699 vastaavalle kontrollille. Kutakin tapausta kohti valitaan kolme kontrollihenkilöä naisten kohortista seuraavien kriteerien perusteella: ei syöpää, samanlainen ikä ilmoittautumishetkellä (5 vuoden sisällä), samanlainen rotu, verinäytteiden saatavuus, samanlainen ajankohta verenotto.