The Andromeda Study.Valore predittivo dei criteri combinati per personalizzare lo screening del cancro al seno.

Il cancro al seno (BC) rappresenta la neoplasia più frequente nelle donne in tutto il mondo. In Italia circa 1 tumore maligno su 3 nelle donne (29%) è un BC (esclusi i tumori cutanei) come riportato dai registri tumori italiani tra il 2006 e il 2009. I risultati di studi randomizzati, riassunti in una revisione aggiornata e in una meta-analisi per la US Preventive Task Force di Nelson et al., hanno mostrato che la partecipazione a un programma di screening mammografico riduce la mortalità di BC del 14-32%, a seconda della fascia di età. In Italia, lo screening mammografico per la diagnosi precoce è stato implementato su base regionale in diverse aree italiane. In conformità alle linee guida nazionali e internazionali, la maggior parte dei programmi invita le donne di età compresa tra 50 e 69 anni a sottoporsi a mammografia ogni due anni.

Sebbene la mammografia sia diventata uno standard di cura nello screening della BC, i suoi limiti sono ben riconosciuti (sovradiagnosi, uso di radiazioni ionizzanti, scarsa accuratezza nelle donne con tessuto mammario denso, un tasso relativamente alto di falsi positivi e disagio personale). Inoltre, gli attuali protocolli di screening si basano solo sull'età della donna, ignorando altri fattori di rischio e definendo un'unica periodicità di screening all'interno della fascia di età prestabilita.

Le attuali sfide nella gestione della BC includono la ricerca di biomarcatori minimamente invasivi sensibili e specifici associati ai primi cambiamenti neoplastici. Un certo numero di marcatori tumorali circolanti (come l'antigene carcino-embrionale, il CEA o l'antigene dei carboidrati 15-3, CA 15-3) sono ampiamente utilizzati nella manipolazione del BC, ma la loro sensibilità è molto bassa. I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti (lungi circa 18-25 nucleotidi) che regolano l'espressione genica all'interno delle cellule degradando l'mRNA o inibendo la sintesi proteica. Poiché possono avere centinaia di bersagli, sono in grado di controllare diversi processi biologici all'interno delle cellule. Vi sono prove crescenti che i miRNA possono anche essere rilasciati al di fuori delle cellule e sono già stati rilevati livelli aumentati di miRNA rilasciati dal tumore e dal suo microambiente, nonché una diminuzione dei livelli fisiologici di miRNA circolanti nel siero/plasma di pazienti oncologici. Il potenziale utilizzo di tali molecole per scopi diagnostici/prognostici nei confronti del carcinoma mammario è stato ampiamente valutato e la loro stabilità nei fluidi corporei ha aperto nuove opportunità per anticipare la diagnosi di BC, con interventi minimamente invasivi soprattutto per le donne a più alto rischio.

Ipotesi: programmi di screening basati sul rischio secondo diversi criteri di rischio BC (es. densità del seno, stime basate su modelli di rischio assoluto, stili di vita) possono massimizzare l'impatto dello screening in gruppi di donne caratterizzate da rischi diversi. La raccolta di dati per la stratificazione del rischio nei programmi di screening basati sulla popolazione richiede una grande quantità di risorse. I criteri non indipendenti che identificano le stesse donne a più alto rischio sono ridondanti e dovrebbero essere considerati mutuamente esclusivi. I biomarcatori molecolari del sangue altamente accurati e convalidati associati al rischio di BC possono rappresentare uno strumento complementare alla mammografia nel contesto dello screening primario.

Il primo obiettivo dello studio è valutare e confrontare, in un'ampia coorte di donne, il valore predittivo dei criteri disponibili per definire il rischio BC al fine di identificare opportune stratificazioni basate sul rischio per uno screening personalizzato. I criteri considerati sono:

io. fattori di rischio generali raccolti attraverso un questionario di rischio standardizzato (ad es. fattori riproduttivi, storia familiare di primo grado, storia della biopsia, attività fisica, indice di massa corporea e consumo di alcol). Per questa categoria il rischio assoluto sarà valutato utilizzando il modello di previsione del rischio di Petracci et al. che è stato sviluppato per la popolazione italiana e validato su una coorte indipendente di donne italiane.

ii. densità del seno; iii.stili di vita della donna (attraverso un dettagliato questionario sulle abitudini alimentari e sull'attività fisica).

Lo studio è finalizzato al raggiungimento dei seguenti obiettivi secondari rispetto al primo obiettivo:

Per misurare gli indicatori di prestazione dello screening specifici per età e rischio (ad es. tasso di rilevamento, tasso di richiamo e rapporto tra biopsie chirurgiche benigne/maligne).

Quantificare l'impatto di potenziali interventi di screening su misura sugli esiti sanitari e sui costi attraverso la conoscenza della distribuzione dei fattori di rischio nella popolazione target; Valutare la fattibilità economica e organizzativa di un potenziale intervento su misura e progettare strategie stratificate di screening del cancro al seno per la futura implementazione del programma pilota di screening; L'estensione del follow up oltre la durata triennale del progetto consentirà di determinare stime ancora più coerenti dei valori predittivi sopra menzionati e di valutare i criteri/fattori di rischio considerati in questo studio in un'analisi multivariata.

Il secondo obiettivo principale è indagare se i miRNA circolanti selezionati precedentemente trovati associati al rischio di BC sono significativamente alterati nel plasma dei pazienti oncologici rispetto ai controlli sani abbinati e se soddisfano tassi di veri e falsi positivi pre-specificati che sono considerati minimamente accettabili nella cornice della proiezione.

Sotto-obiettivi correlati:

• valutare l'associazione tra fattori come l'età, la densità del seno, i fattori riproduttivi e la storia familiare, nonché lo stile di vita e il livello di miRNA nella popolazione senza cancro. Se tali fattori influenzano il biomarcatore, potrebbe essere necessario definire separatamente la soglia per la positività dello screening per le sottopopolazioni di screening, al fine di mantenere basso il tasso di falsi positivi per ciascuna. - Valutare i fattori associati al livello di miRNA nei casi di cancro, in particolare le caratteristiche della malattia come stadio, grado e fattori prognostici disponibili. Comprendere la natura del cancro rilevato con un biomarcatore è una questione fondamentale. Un biomarcatore che rileva il cancro in una fase iniziale è più prezioso per scopi preventivi di uno che rileva solo i tumori in fase avanzata.
• valutare la presenza di 18 SNP di rischio di cancro al seno attualmente stabiliti ottenuti da studi di associazione su tutto il genoma (GWAS) che hanno identificato alleli comuni a bassa penetranza associati al rischio di cancro al seno in più loci genetici e testare la loro associazione con miRNA circolanti, densità mammaria e screening risultato.

Fase 1 - Arruolamento A circa 36.600 donne (fascia di età: 46-67 anni) che partecipano al programma di screening BC in aree selezionate, verrà offerta la partecipazione allo studio Andromeda, di cui 22.000 dovrebbero fornire il consenso informato. Al momento dell'arruolamento verranno raccolte informazioni sui fattori di rischio di BC e sullo stile di vita, insieme alla densità mammaria e ai campioni di sangue per la conservazione di siero, plasma e buffy-coat.

Alle donne che accetteranno di partecipare ad Andromeda verrà chiesto di compilare un questionario per progettare il loro rischio standard di BC e un questionario dettagliato sui loro stili di vita. Verrà inoltre chiesto loro di fornire un campione di sangue.

Inoltre, la densità del seno verrà calcolata durante l'esame del seno. Gli esami saranno letti da due radiologi esperti e la densità mammaria sarà classificata in categorie mediante il Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS).

Le donne che accettano il prelievo di sangue riceveranno un appuntamento specifico dove personale addestrato, oltre al prelievo di sangue, raccoglierà le misure antropometriche e le supporterà nella compilazione dei questionari dello studio, se necessario.

Dato che la positività per il seno denso, il punteggio di Gail, il rischio correlato allo stile di vita e il miRNA sono determinati sugli stessi soggetti, viene fornita la stima più efficiente del rapporto tra valori predittivi positivi (PPV) relativi (positivi vs. negativi) per due diversi fattori da a x b/c x d, dove a = tumori positivi al fattore 1 ma non al fattore 2; b= donne con anomalie mammografiche ma senza tumore, positive al fattore 2 ma non al fattore 1; c=tumori positivi per fattore 2 a ma non per fattore 1; d= donne con mammografia anormale ma senza cancro, positive per il fattore 1 ma non per il fattore 2. Supponendo che il 40% delle 21000 donne arruolate abbia un seno denso, il 20% un certo punteggio di Gail, il 50% un rischio legato allo stile di vita e il 20% un dato miRNA, che l'11% delle donne dello studio è portatore di cancro al seno e che il PPV complessivo della mammografia è del 20%, sono previsti circa 100-120 tumori discordanti e 640-740 donne discordanti con mammografia anomala ma nessun cancro per le coppie di fattori considerate. Sotto questi presupposti, lo studio ha un potere dell'80% per rifiutare (alfa = 0,05) l'ipotesi nulla che il rapporto PPV relativo sia = 1 se il suo valore reale è almeno 1,8-2,0, a seconda della coppia di fattori considerati.

Fase 2 - Analisi dei biomarcatori Lo studio Andromeda comprende le analisi molecolari per la valutazione degli SNP e dei miRNA circolanti che verranno eseguite in cieco su un opportuno campione caso-controllo estratto dalla coorte di donne arruolate, non appena sarà raggiunto un numero minimo di casi di BC . L'accecamento consente di evitare che la conoscenza dello stato dell'esito del soggetto influisca sull'interpretazione di un risultato del test o sulla cura con cui viene maneggiato il campione. Il DNA genomico sarà estratto dal buffy coat con il kit di preparazione High Pure PCR Template. 18 SNPs saranno amplificati mediante PCR e valutati su un apparato qPCR con saggi specifici. The 18 breast cancer risk related SNPs are: rs11249433, rs1045485, rs13387042, rs4973768, rs10941679, rs889312, rs2046210, rs13281615, rs1011970, rs2981582, rs2380205, rs10995190, rs704010, rs3817198, rs614367, rs999737, rs3803662 and rs6504950.

L'estrazione dell'RNA totale circolante da campioni di plasma sarà effettuata con miRNeasy minikit secondo il protocollo Exiqon, che implica l'uso di un vettore di RNA (batteriofage MS2 RNA, Roche Diagnostics) per promuovere la precipitazione dell'RNA e la sua purificazione sulle membrane. Cel-miR-139 sarà utilizzato come controllo spike-in per controllare la resa di estrazione e per normalizzare i dati, insieme a hasmiR-1228. I campioni di RNA saranno eluiti con acqua priva di nucleasi e conservati a -80°C. Verrà applicato un nuovo metodo per controllare l'emolisi.

Per calcolare la dimensione del campione necessaria per la valutazione cardine dei biomarcatori (espressi su una scala continua), i livelli minimamente accettabili e desiderabili delle tipiche misure di performance di interesse, come il tasso di veri positivi (TPR) e il tasso di falsi positivi ( FPR) sono stati definiti. Per lo screening della popolazione generale, il tasso di falsi positivi deve essere piuttosto basso per evitare che un numero enorme di persone si sottoponga a procedure mediche costose e non necessarie. Pertanto, abbiamo ipotizzato un tasso di falsi positivi massimo accettabile (FPR0) del 4% (la specificità minima accettabile è quindi del 96%) e una sensibilità minima accettabile dell'80% (TPR0). L'ipotesi nulla da rifiutare è la seguente: H0: TPR0≤0.80 o FPR0≥0.04.

La dimensione del campione richiesta con una potenza dell'80% (alfa=5%) e assumendo un tasso desiderabile di veri positivi e un tasso di falsi positivi di TPR1=0,90 e FPR1=0,05, rispettivamente, era di 179 casi e 537 controlli. Il calcolo della dimensione del campione era basato teoricamente sulla curva ROC. Ipotizzando un tasso annuale di rilevamento di BC (DR) di 0,006 nel primo anno e di 0,005 nel secondo anno dello studio (quindi il DR biennale considerato era 0,011) si prevede che un totale di 233 pazienti nei primi due anni dello studio essere osservati, superando così i 179 richiesti. Queste stime si basano sui DR osservati negli anni precedenti negli stessi centri considerati in questo studio. Pertanto, le analisi molecolari saranno effettuate su 233 casi e 699 controlli appaiati. Per ogni caso, tre soggetti di controllo saranno selezionati dalla coorte di donne, sulla base dei seguenti criteri: nessuna storia di cancro, età simile all'arruolamento (entro 5 anni), razza simile, disponibilità di campione di sangue, data simile di prelievo di sangue.