The Andromeda Study. Prediktivní hodnota kombinovaných kritérií pro přizpůsobení screeningu rakoviny prsu.

Karcinom prsu (BC) představuje celosvětově nejčastější novotvar u žen. V Itálii je asi 1 ze 3 zhoubných nádorů u žen (29 %) BC (bez kožních nádorů), jak uvádí italské registry rakoviny v letech 2006 až 2009. Výsledky randomizovaných studií, shrnuté v aktualizovaném přehledu a metaanalýze pro U.S. Preventive Task Force od Nelsona et al., ukázaly, že účast na mamografickém screeningovém programu snižuje mortalitu BC o 14–32 % v závislosti na věkovém rozmezí. V Itálii byl mamografický screening pro včasnou diagnózu zaveden na regionální bázi v několika italských oblastech. V souladu s národními a mezinárodními směrnicemi většina programů vyzývá ženy ve věku 50 až 69 let, aby podstoupily mamografii každé dva roky.

Přestože se mamografie stala standardem péče v BC screeningu, její omezení jsou dobře známá (nadměrná diagnostika, použití ionizujícího záření, špatná přesnost u žen s hustou prsní tkání, relativně vysoká míra falešně pozitivních výsledků a osobní nepohodlí). Současné screeningové protokoly jsou navíc založeny pouze na věku ženy, ignorují ostatní rizikové faktory a definují jedinou periodicitu screeningu v rámci předem stanoveného věkového rozmezí.

Současné výzvy v léčbě BC zahrnují hledání citlivých a specifických minimálně invazivních biomarkerů spojených s časnými neoplastickými změnami. Řada cirkulujících nádorových markerů (jako karcinoembryonální antigen, CEA nebo sacharidový antigen 15-3, CA 15-3) se široce používá při manipulaci s BC, ale jejich citlivost je velmi nízká. MikroRNA (miRNA) jsou malé nekódující RNA (dlouhé asi 18-25 nukleotidů), které regulují genovou expresi uvnitř buněk degradací mRNA nebo inhibicí syntézy proteinů. Protože mohou mít stovky cílů, jsou schopny řídit několik biologických procesů uvnitř buněk. Přibývá důkazů, že miRNA mohou být také uvolňovány mimo buňky a zvýšené hladiny miRNA uvolňované nádorem a jeho mikroprostředím, stejně jako snížení fyziologických hladin miRNA v oběhu, již byly detekovány v séru/plazmě pacientů s rakovinou. Potenciální použití takových molekul pro diagnostické/prognostické účely s ohledem na rakovinu prsu bylo rozsáhle hodnoceno a jejich stabilita v tělesných tekutinách otevřela nové možnosti pro předvídání diagnózy BC s minimálně invazivní intervencí, zejména u žen s vyšším rizikem.

Hypotéza: Screeningové programy založené na riziku podle různých kritérií rizika BC (tj. hustota prsou, modelové odhady absolutního rizika, životní styl) mohou maximalizovat dopad screeningu u skupin žen charakterizovaných různými riziky. Shromažďování údajů pro stratifikaci rizik v populačních screeningových programech vyžaduje velké množství zdrojů. Nezávislá kritéria, která identifikují stejné ženy s vyšším rizikem, jsou nadbytečná a měla by se považovat za vzájemně se vylučující. Validované vysoce přesné krevní molekulární biomarkery spojené s rizikem BC mohou představovat doplňkový nástroj k mamografii v prostředí primárního screeningu.

Prvním cílem studie je vyhodnotit a porovnat u velké skupiny žen prediktivní hodnotu dostupných kritérií pro definování rizika BC, aby bylo možné identifikovat vhodné stratifikace založené na riziku pro personalizovaný screening. Uvažovaná kritéria jsou:

i. obecné rizikové faktory shromážděné prostřednictvím standardizovaného rizikového dotazníku (např. reprodukční faktory, rodinná anamnéza 1. stupně, bioptická anamnéza, fyzická aktivita, BMI a konzumace alkoholu). Pro tuto kategorii bude absolutní riziko hodnoceno pomocí modelu predikce rizika Petracciho et al. který byl vyvinut pro italskou populaci a ověřen na nezávislé kohortě italských žen.

ii. hustota prsou; iii. životní styl ženy (prostřednictvím podrobného dotazníku o stravovacích návycích a fyzické aktivitě).

Studie je navržena tak, aby dosáhla následujících sekundárních cílů souvisejících s prvním cílem:

K měření ukazatelů výkonnosti screeningu specifických pro věk a riziko (tj. četnost detekce, četnost vyvolání paměti a poměr benigní/maligní chirurgické biopsie).

Kvantifikovat dopad potenciálních intervencí přizpůsobeného screeningu na zdravotní výsledky a náklady na základě znalosti distribuce rizikových faktorů v cílové populaci; Vyhodnotit ekonomickou a organizační proveditelnost potenciální intervence na míru a navrhnout strategie stratifikovaného screeningu rakoviny prsu pro budoucí implementaci pilotního screeningového programu; Prodloužení sledování nad rámec tříletého trvání projektu nám umožní stanovit ještě konzistentnější odhady výše uvedených prediktivních hodnot a vyhodnotit kritéria/rizikové faktory uvažované v této studii ve vícerozměrných analýzách.

Druhým hlavním cílem je prozkoumat, zda vybrané cirkulující miRNA dříve zjištěné spojené s rizikem BC jsou významně změněny v plazmě pacientů s rakovinou ve srovnání s odpovídajícími zdravými kontrolami a zda splňují předem specifikované pravdivě a falešně pozitivní hodnoty, které jsou považovány za minimálně přijatelné. v nastavení promítání.

Související dílčí cíle:

• posoudit souvislost mezi faktory, jako je věk, hustota prsou, reprodukční faktory a rodinná anamnéza, stejně jako životní styl a hladina miRNA v populaci bez rakoviny. Pokud takové faktory ovlivňují biomarker, může být nutné definovat práh pozitivity screeningu samostatně pro screeningové subpopulace, aby se u každého udržela míra falešně pozitivních výsledků na nízké úrovni. - Posoudit faktory spojené s hladinou miRNA u případů rakoviny - zejména charakteristiky onemocnění, jako je stadium, stupeň a dostupné prognostické faktory. Klíčovým problémem je porozumění povaze rakoviny, která je detekována biomarkerem. Biomarker, který detekuje rakovinu v časném stadiu, je pro preventivní účely cennější než ten, který detekuje pouze rakovinu v pozdním stadiu.
• vyhodnotit přítomnost 18 aktuálně stanovených SNP s rizikem rakoviny prsu získaných celogenomovými asociačními studiemi (GWAS), které identifikovaly běžné alely s nízkou penetrací spojené s rizikem rakoviny prsu na více genetických lokusech, a otestovat jejich souvislost s cirkulujícími miRNA, hustotou prsu a screeningem výsledek.

Fáze 1 – Zápis Asi 36 600 ženám (věkové rozmezí: 46-67 let), které se účastní programu BC screeningu ve vybraných oblastech, bude nabídnuta účast ve studii Andromeda, z nichž se očekává, že 22 000 poskytne informovaný souhlas. Při zápisu budou shromážděny informace o rizikových faktorech BC a životním stylu spolu s hustotou prsou a vzorky krve pro uložení séra, plazmy a buffy-coat.

Ženy, které budou souhlasit s účastí v Andromedě, budou požádány o vyplnění dotazníku, který navrhne jejich standardní riziko BC, a podrobný dotazník o jejich životním stylu. Budou také požádáni, aby poskytli vzorek krve.

Dále bude při vyšetření prsu vypočtena hustota prsou. Vyšetření budou číst dva odborní radiologové a hustota prsů bude klasifikována do kategorií pomocí systému Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS).

Ženy přijímající odběry krve obdrží konkrétní schůzku, kde vyškolený personál kromě odběru krve shromáždí antropometrická měření a v případě potřeby je podpoří při vyplňování dotazníků studie.

Vzhledem k tomu, že pozitivita pro hustá prsa, Gail skóre, riziko související s životním stylem a miRNA jsou stanoveny na stejných subjektech, je uveden nejúčinnější odhad poměru mezi relativními (pozitivní vs. negativní) poměry pozitivních prediktivních hodnot (PPV) pro dva různé faktory. pomocí a x b/c x d, kde a = rakovina pozitivní faktor 1, ale ne faktor 2; b= ženy s abnormální mamografií, ale bez rakoviny, pozitivní na faktor 2, ale ne na faktor 1; c=rakoviny pozitivní na faktor 2 až ale ne na faktor 1; d= ženy s abnormální mamografií, ale bez rakoviny, pozitivní na faktor 1, ale ne na faktor 2. Za předpokladu, že 40 % z 21 000 zapsaných žen má hustá prsa, 20 % určité Gail skóre, 50 % riziko životního stylu a 20 % daný miRNA, že 11 % studovaných žen má rakovinu prsu a že celková PPV mamografie je 20 %, u uvažovaných párů faktorů se neočekává asi 100-120 nesouhlasných rakovin a 640-740 nesouhlasných žen s abnormální mamografií, ale bez rakoviny. Za těchto předpokladů má studie 80% sílu odmítnout (alfa = 0,05) nulovou hypotézu, že relativní poměr PPV je =1, pokud je jeho skutečná hodnota alespoň 1,8-2,0, v závislosti na dvou zvažovaných faktorech.

Fáze 2 – Analýza biomarkerů Studie Andromeda zahrnuje molekulární analýzy k vyhodnocení SNP a cirkulujících miRNA, které budou provedeny naslepo na vhodném vzorku případové kontroly extrahovaném z kohorty zařazených žen, jakmile bude dosaženo minimálního počtu případů BC. . Zaslepení umožňuje zabránit tomu, aby znalost výsledného stavu subjektu ovlivňovala interpretaci výsledku testu nebo péči, s jakou je se vzorkem zacházeno. Genomová DNA bude extrahována z buffy coat přípravnou sadou High Pure PCR Template. 18 SNP bude amplifikováno pomocí PCR a vyhodnoceno na přístroji qPCR se specifickými testy. The 18 breast cancer risk related SNPs are: rs11249433, rs1045485, rs13387042, rs4973768, rs10941679, rs889312, rs2046210, rs13281615, rs1011970, rs2981582, rs2380205, rs10995190, rs704010, rs3817198, rs614367, rs999737, rs3803662 and rs6504950.

Cirkulující extrakce celkové RNA ze vzorků plazmy bude prováděna pomocí minikitu miRNeasy podle protokolu Exiqon, což znamená použití nosiče RNA (bateriofage MS2 RNA, Roche Diagnostics) k podpoře precipitace RNA a její purifikace na membránách. Cel-miR-139 bude spolu s hasmiR-1228 použit jako kontrola spike-in ke kontrole výtěžku extrakce a k normalizaci dat. Vzorky RNA budou eluovány vodou bez nukleázy a skladovány při -80 °C. Bude použita nová metoda kontroly hemolýzy.

Pro výpočet velikosti vzorku nezbytného pro stěžejní hodnocení biomarkerů (vyjádřených na kontinuální stupnici) jsou minimální přijatelné a žádoucí úrovně typických ukazatelů výkonnosti, které nás zajímají, jako je skutečně pozitivní míra (TPR) a míra falešně pozitivních výsledků ( FPR) byly definovány. U plošného screeningu populace musí být míra falešně pozitivních výsledků poměrně nízká, aby se zabránilo velkému počtu lidí, kteří podstoupí zbytečné nákladné lékařské procedury. Předpokládali jsme tedy maximálně přijatelnou míru falešně pozitivních výsledků (FPR0) 4 % (minimálně přijatelná specificita je tedy 96 %) a minimálně přijatelnou senzitivitu 80 % (TPR0). Nulová hypotéza, která má být zamítnuta, je následující: H0: TPR0≤0,80 nebo FPR0≥0,04.

Požadovaná velikost vzorku s 80% mocninou (alfa=5 %) a za předpokladu žádoucí četnosti pravdivě pozitivních a falešně pozitivních TPR1=0,90 a FPR1=0,05, v tomto pořadí bylo 179 případů a 537 kontrol. Výpočet velikosti vzorku byl založen teoreticky na ROC křivce. Za předpokladu roční míry detekce BC (DR) 0,006 v prvním roce a 0,005 ve druhém roce studie (proto uvažovaná dvouletá DR byla 0,011) se očekává, že celkem 233 pacientů s případem v prvních dvou letech studie být dodržen, čímž překročí požadovaných 179. Tyto odhady jsou založeny na DR pozorovaných v předchozích letech ve stejných centrech, o kterých se uvažuje v této studii. Molekulární analýzy tedy budou provedeny na 233 případech a 699 odpovídajících kontrolách. Pro každý případ budou z kohorty žen vybrány tři kontrolní subjekty na základě následujících kritérií: žádná anamnéza rakoviny, podobný věk při zařazení (do 5 let), podobná rasa, dostupnost vzorku krve, podobné datum odběr krve.