The Andrômeda Study.Valor Preditivo de Critérios Combinados para Adaptar o Rastreamento de Câncer de Mama.

O câncer de mama (CM) representa a neoplasia mais frequente em mulheres em todo o mundo. Na Itália, cerca de 1 em cada 3 cânceres malignos em mulheres (29%) é um CM (deixando de fora os tumores cutâneos), conforme relatado pelos registros italianos de câncer entre 2006 e 2009. Os resultados de estudos randomizados, resumidos em uma revisão atualizada e meta-análise para a Força-Tarefa Preventiva dos EUA por Nelson et al., mostraram que participar de um programa de rastreamento mamográfico reduz a mortalidade por CM de 14 a 32%, dependendo da faixa etária. Na Itália, a mamografia para diagnóstico precoce foi implementada regionalmente em várias áreas italianas. Atendendo a diretrizes nacionais e internacionais, a maioria dos programas convida mulheres de 50 a 69 anos a realizar mamografia a cada dois anos.

Embora a mamografia tenha se tornado padrão de tratamento no rastreamento de CM, suas limitações são bem reconhecidas (sobrediagnóstico, uso de radiação ionizante, baixa precisão em mulheres com tecido mamário denso, taxa relativamente alta de falsos positivos e desconforto pessoal). Além disso, os protocolos de triagem atuais são baseados apenas na idade da mulher, ignorando outros fatores de risco e definindo uma única periodicidade de triagem dentro da faixa etária pré-especificada.

Os desafios atuais no manejo do CM incluem a busca por biomarcadores minimamente invasivos sensíveis e específicos associados a alterações neoplásicas precoces. Vários marcadores tumorais circulantes (como antígeno carcinoembrionário, CEA ou antígeno de carboidrato 15-3, CA 15-3) são amplamente utilizados no manuseio do BC, mas sua sensibilidade é muito baixa. MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes (cerca de 18-25 nucleotídeos de comprimento), que regulam a expressão gênica dentro das células degradando o mRNA ou inibindo a síntese de proteínas. Como podem ter centenas de alvos, são capazes de controlar diversos processos biológicos dentro das células. Há evidências crescentes de que os miRNAs também podem ser liberados fora das células, e o aumento dos níveis de miRNAs liberados pelo tumor e seu microambiente, bem como a diminuição dos níveis fisiológicos de miRNAs circulantes, já foram detectados no soro/plasma de pacientes com câncer. O potencial uso dessas moléculas para fins diagnósticos/prognósticos em relação ao câncer de mama tem sido extensivamente avaliado e sua estabilidade em fluidos corporais abriu novas oportunidades para antecipar o diagnóstico de CM, com intervenção minimamente invasiva especialmente para mulheres de maior risco.

Hipótese: Programas de triagem baseados em risco de acordo com diferentes critérios de risco BC (ou seja, densidade mamária, estimativas baseadas em modelos de risco absoluto, estilos de vida) podem maximizar o impacto da triagem em grupos de mulheres caracterizados por diferentes riscos. A coleta de dados para estratificação de risco em programas de triagem de base populacional requer grande quantidade de recursos. Critérios não independentes que identificam as mesmas mulheres em maior risco são redundantes e devem ser considerados mutuamente exclusivos. Biomarcadores moleculares sanguíneos altamente precisos e validados associados ao risco de CM podem representar uma ferramenta complementar à mamografia no cenário de triagem primária.

O primeiro objetivo do estudo é avaliar e comparar, em uma grande coorte de mulheres, o valor preditivo dos critérios disponíveis para definir o risco de CM, a fim de identificar estratificações baseadas em risco apropriadas para triagem personalizada. Os critérios considerados são:

eu. fatores de risco gerais coletados por meio de um questionário de risco padronizado (por exemplo, fatores reprodutivos, história familiar de primeiro grau, história de biópsia, atividade física, IMC e consumo de álcool). Para esta categoria o risco absoluto será avaliado utilizando o modelo de predição de risco de Petracci et al. que foi desenvolvido para a população italiana e validado em uma coorte independente de mulheres italianas.

ii. densidade da mama; iii. estilos de vida da mulher (através de um questionário detalhado sobre hábitos alimentares e atividade física).

O estudo é projetado para atingir os seguintes objetivos secundários relacionados ao primeiro objetivo:

Para medir indicadores de desempenho de triagem específicos para idade e risco (ou seja, taxa de detecção, taxa de reconvocação e taxa de biópsia cirúrgica benigna/maligna).

Quantificar o impacto de potenciais intervenções de rastreio personalizado nos resultados e custos de saúde através do conhecimento da distribuição dos fatores de risco na população-alvo; Avaliar a viabilidade econômica e organizacional de uma potencial intervenção personalizada e projetar estratégias estratificadas de rastreamento do câncer de mama para a futura implementação do programa piloto de rastreamento; A extensão do acompanhamento para além dos três anos de duração do projeto permitirá determinar estimativas ainda mais consistentes dos valores preditivos acima mencionados e avaliar os critérios/fatores de risco considerados neste estudo em uma análise multivariada.

O segundo objetivo principal é investigar se os miRNAs circulantes selecionados anteriormente associados ao risco de CM são significativamente alterados no plasma de pacientes com câncer em comparação com controles saudáveis ​​pareados e se satisfazem taxas pré-especificadas de verdadeiro e falso-positivo que são consideradas minimamente aceitáveis no cenário de triagem.

Subobjetivos relacionados:

• avaliar a associação entre fatores como idade, densidade mamária, fatores reprodutivos e história familiar, bem como estilo de vida e nível de miRNA na população livre de câncer. Se tais fatores afetarem o biomarcador, o limite para a positividade do rastreamento pode precisar ser definido separadamente para as subpopulações de rastreamento, a fim de manter a taxa de falsos positivos em um nível baixo para cada uma. - Avaliar fatores associados ao nível de miRNA em casos de câncer - em particular, características da doença, como estágio, grau e fatores prognósticos disponíveis. Compreender a natureza do câncer que é detectado com um biomarcador é uma questão fundamental. Um biomarcador que detecta o câncer em estágio inicial é mais valioso para fins preventivos do que aquele que detecta apenas cânceres em estágio avançado.
• avaliar a presença de 18 SNPs de risco de câncer de mama atualmente estabelecidos obtidos por estudos de associação do genoma (GWAS) que identificaram alelos comuns de baixa penetrância associados ao risco de câncer de mama em múltiplos loci genéticos e testar sua associação com miRNAs circulantes, densidade da mama e triagem resultado.

Fase 1 - Inscrição Cerca de 36.600 mulheres (faixa etária: 46-67 anos) participantes do programa de triagem de BC em áreas selecionadas terão participação no estudo Andromeda, das quais 22.000 deverão fornecer consentimento informado. No ato da inscrição serão coletadas informações sobre fatores de risco para o CM e estilo de vida, densidade mamária e amostras de sangue para armazenamento de soro, plasma e buffy-coat.

As mulheres que concordarem em participar do Andromeda serão solicitadas a preencher um questionário para projetar seu risco padrão de BC e um questionário detalhado sobre seus estilos de vida. Eles também serão solicitados a fornecer uma amostra de sangue.

Além disso, a densidade da mama será calculada durante o exame da mama. Os exames serão lidos por dois radiologistas especialistas e a densidade das mamas será classificada em categorias por meio do Sistema de Relatórios e Dados de Imagens de Mama (BI-RADS).

As mulheres que aceitarem a coleta de sangue receberão uma consulta específica onde pessoal treinado, além da coleta de sangue, fará a coleta de medidas antropométricas e as apoiará no preenchimento dos questionários do estudo, se necessário.

Dado que a positividade para mama densa, pontuação de Gail, risco relacionado ao estilo de vida e miRNA são determinados nos mesmos indivíduos, é fornecida a estimativa mais eficiente da proporção entre as proporções de valores preditivos positivos (VPP) relativos (positivos versus negativos) para dois fatores diferentes por a x b/c x d, onde a = fator 1 positivo para câncer, mas não para fator 2; b= mulheres com mamografia anormal, mas sem câncer, positivo para fator 2, mas não para fator 1; c=cânceres positivos para fator 2 a, mas não para fator 1; d= mulheres com mamografia anormal, mas sem câncer, positivo para o fator 1, mas não para o fator 2. Supondo que 40% das 21.000 mulheres inscritas tenham uma mama densa, 20% um certo escore de Gail, 50% um risco de estilo de vida e 20% um dado miRNA, que 11% das mulheres do estudo carregam câncer de mama e que o PPV geral da mamografia é de 20%, cerca de 100-120 cânceres discordantes e 640-740 mulheres discordantes com mamografia anormal, mas nenhum câncer é esperado para os pares de fatores considerados. Sob essas suposições, o estudo tem 80% de poder para rejeitar (alfa = 0,05) a hipótese nula de que a relação VPP relativa é = 1 se seu valor verdadeiro for de pelo menos 1,8-2,0, dependendo do par de fatores considerados.

Fase 2 - Análise de biomarcadores O estudo Andromeda compreende as análises moleculares para avaliar SNPs e miRNAs circulantes que serão realizadas cegamente em uma amostra de caso-controle apropriada extraída da coorte de mulheres inscritas, assim que um número mínimo de casos de BC for atingido . A ocultação permite evitar que o conhecimento do status do resultado do sujeito afete a interpretação de um resultado de ensaio ou o cuidado com o qual a amostra é manuseada. O DNA genômico será extraído do buffy coat com kit de preparação High Pure PCR Template. 18 SNPs serão amplificados por PCR e avaliados em um aparelho de qPCR com ensaios específicos. The 18 breast cancer risk related SNPs are: rs11249433, rs1045485, rs13387042, rs4973768, rs10941679, rs889312, rs2046210, rs13281615, rs1011970, rs2981582, rs2380205, rs10995190, rs704010, rs3817198, rs614367, rs999737, rs3803662 and rs6504950.

A extração de RNA total circulante de amostras de plasma será realizada com minikit miRNeasy de acordo com o protocolo Exiqon, implicando o uso de um transportador de RNA (batteriofage MS2 RNA, Roche Diagnostics) para promover a precipitação de RNA e sua purificação em membranas. O Cel-miR-139 será usado como controle de pico para verificar o rendimento da extração e normalizar os dados, juntamente com o hasmiR-1228. Amostras de RNA serão eluídas com água livre de nuclease e armazenadas a -80° C. Um novo método para verificar a hemólise será aplicado.

Para calcular o tamanho da amostra necessário para a avaliação fundamental dos biomarcadores (expressos em uma escala contínua), níveis minimamente aceitáveis ​​e desejáveis ​​de medidas de desempenho típicas de interesse, como a taxa de verdadeiros positivos (TPR) e a taxa de falsos positivos ( FPR) foram definidos. Para a triagem da população em geral, a taxa de falsos positivos deve ser bastante baixa para evitar que um grande número de pessoas seja submetido a procedimentos médicos dispendiosos desnecessários. Assim, hipotetizamos uma taxa de falsos positivos máxima aceitável (FPR0) de 4% (a especificidade minimamente aceitável é, portanto, 96%) e uma sensibilidade minimamente aceitável de 80% (TPR0). A hipótese nula a ser rejeitada é a seguinte: H0: TPR0≤0,80 ou FPR0≥0,04.

O tamanho da amostra necessário com um poder de 80% (alfa = 5%) e assumindo uma taxa desejável de verdadeiros positivos e falsos positivos de TPR1 = 0,90 e FPR1 = 0,05, respectivamente, foi de 179 casos e 537 controles. O cálculo do tamanho da amostra foi baseado teoricamente na curva ROC. Assumindo uma taxa anual de detecção de BC (DR) de 0,006 no primeiro ano e 0,005 no segundo ano do estudo (portanto, o DR bienal considerado foi de 0,011), espera-se um total de 233 pacientes nos primeiros dois anos do estudo. observados, superando assim os 179 exigidos. Essas estimativas são baseadas em RDs observadas nos anos anteriores nos mesmos centros considerados neste estudo. Assim, as análises moleculares serão realizadas em 233 casos e 699 controles pareados. Para cada caso, três indivíduos de controle serão selecionados da coorte de mulheres, com base nos seguintes critérios: sem histórico de câncer, idade semelhante na inscrição (dentro de 5 anos), raça semelhante, disponibilidade de amostra de sangue, data semelhante de tiragem de sangue.