Die Andromeda-Studie. Vorhersagewert kombinierter Kriterien zur Anpassung der Brustkrebsvorsorge.

Brustkrebs (BC) ist weltweit die häufigste Neoplasie bei Frauen. In Italien ist etwa 1 von 3 bösartigen Krebserkrankungen bei Frauen (29 %) ein BC (ohne Hauttumoren), wie von den italienischen Krebsregistern zwischen 2006 und 2009 gemeldet. Ergebnisse aus randomisierten Studien, zusammengefasst in einer aktualisierten Übersicht und Metaanalyse für die U.S. Preventive Task Force von Nelson et al., zeigten, dass die Teilnahme an einem Mammographie-Screening-Programm die BC-Mortalität je nach Altersgruppe um 14-32 % senkt. In Italien wurde das Mammographie-Screening zur Früherkennung auf regionaler Basis in mehreren italienischen Gebieten eingeführt. In Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Richtlinien laden die meisten Programme Frauen im Alter von 50 bis 69 Jahren alle zwei Jahre zur Mammographie ein.

Obwohl die Mammographie zum Behandlungsstandard beim BC-Screening geworden ist, sind ihre Grenzen bekannt (Überdiagnose, Verwendung ionisierender Strahlung, schlechte Genauigkeit bei Frauen mit dichtem Brustgewebe, eine relativ hohe Rate falsch positiver Ergebnisse und persönliches Unbehagen). Darüber hinaus basieren die aktuellen Screening-Protokolle nur auf dem Alter der Frau, ignorieren andere Risikofaktoren und definieren eine einzige Screening-Periodizität innerhalb des vorgegebenen Altersbereichs.

Zu den aktuellen Herausforderungen bei der Behandlung von BC gehört die Suche nach sensitiven und spezifischen minimal-invasiven Biomarkern, die mit frühen neoplastischen Veränderungen assoziiert sind. Eine Reihe zirkulierender Tumormarker (wie karzino-embryonales Antigen, CEA oder Kohlenhydrat-Antigen 15-3, CA 15-3) werden häufig im BC-Handling verwendet, aber ihre Sensitivität ist sehr gering. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht kodierende RNAs (ca. 18-25 Nukleotide lang), die die Genexpression innerhalb von Zellen regulieren, indem sie mRNA abbauen oder die Proteinsynthese hemmen. Da sie Hunderte von Zielen haben können, sind sie in der Lage, mehrere biologische Prozesse in Zellen zu kontrollieren. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass miRNAs auch außerhalb von Zellen freigesetzt werden können, und im Serum/Plasma von Krebspatienten wurden bereits erhöhte Spiegel von miRNAs, die vom Tumor und seiner Mikroumgebung freigesetzt werden, sowie eine Abnahme der physiologischen zirkulierenden miRNA-Spiegel nachgewiesen. Die potenzielle Verwendung solcher Moleküle zu diagnostischen/prognostischen Zwecken in Bezug auf Brustkrebs wurde umfassend evaluiert, und ihre Stabilität in Körperflüssigkeiten hat neue Möglichkeiten zur Vorwegnahme einer BC-Diagnose eröffnet, mit minimal invasiven Eingriffen, insbesondere für Frauen mit höherem Risiko.

Hypothese: Risikobasierte Screening-Programme nach verschiedenen BC-Risikokriterien (d.h. Brustdichte, modellbasierte Schätzungen des absoluten Risikos, Lebensstil) können die Wirkung des Screenings in Gruppen von Frauen maximieren, die durch unterschiedliche Risiken gekennzeichnet sind. Das Sammeln von Daten für die Risikostratifizierung in bevölkerungsbezogenen Screening-Programmen erfordert eine große Menge an Ressourcen. Nicht unabhängige Kriterien, die dieselben Frauen mit höherem Risiko identifizieren, sind überflüssig und sollten als sich gegenseitig ausschließend betrachtet werden. Validierte hochpräzise molekulare Biomarker im Blut, die mit dem BC-Risiko assoziiert sind, können ein ergänzendes Instrument zur Mammographie im primären Screening-Setting darstellen.

Das erste Ziel der Studie besteht darin, in einer großen Kohorte von Frauen den prädiktiven Wert der verfügbaren Kriterien zur Definition des BC-Risikos zu bewerten und zu vergleichen, um geeignete risikobasierte Stratifizierungen für ein personalisiertes Screening zu identifizieren. Die berücksichtigten Kriterien sind:

ich. allgemeine Risikofaktoren, die über einen standardisierten Risikofragebogen erhoben werden (z. Reproduktionsfaktoren, Familienanamnese ersten Grades, Biopsieanamnese, körperliche Aktivität, BMI und Alkoholkonsum). Für diese Kategorie wird das absolute Risiko unter Verwendung des Risikovorhersagemodells von Petracci et al. die für die italienische Bevölkerung entwickelt und an einer unabhängigen Kohorte italienischer Frauen validiert wurde.

ii. Brustdichte; iii. Lebensstil der Frau (durch einen detaillierten Fragebogen zu Ernährungsgewohnheiten und körperlicher Aktivität).

Die Studie ist darauf ausgelegt, die folgenden sekundären Ziele in Bezug auf das erste Ziel zu erreichen:

Zur Messung alters- und risikospezifischer Screening-Leistungsindikatoren (d. h. Erkennungsrate, Recall-Rate und gutartiges/malignes chirurgisches Biopsie-Verhältnis).

Quantifizierung der Auswirkungen potenzieller Interventionen maßgeschneiderter Screenings auf Gesundheitsergebnisse und -kosten durch Kenntnis der Verteilung von Risikofaktoren in der Zielpopulation; Bewertung der wirtschaftlichen und organisatorischen Machbarkeit potenzieller maßgeschneiderter Interventionen und Entwicklung stratifizierter Brustkrebs-Screening-Strategien für die zukünftige Implementierung von Pilot-Screening-Programmen; Die Verlängerung des Follow-up über die dreijährige Projektlaufzeit hinaus wird es uns ermöglichen, noch konsistentere Schätzungen der oben genannten prädiktiven Werte zu ermitteln und die in dieser Studie berücksichtigten Kriterien/Risikofaktoren in einer multivariaten Analyse zu bewerten.

Das zweite Hauptziel besteht darin, zu untersuchen, ob ausgewählte zirkulierende miRNAs, die zuvor mit BC-Risiko in Verbindung gebracht wurden, im Plasma von Krebspatienten im Vergleich zu passenden gesunden Kontrollen signifikant verändert sind und ob sie vorab festgelegte Richtig- und Falsch-Positiv-Raten erfüllen, die als minimal akzeptabel gelten im Screening-Setting.

Verwandte Teilziele:

• den Zusammenhang zwischen Faktoren wie Alter, Brustdichte, reproduktiven Faktoren und Familienanamnese sowie Lebensstil und miRNA-Level in der krebsfreien Bevölkerung zu bewerten. Wenn solche Faktoren den Biomarker beeinflussen, muss der Schwellenwert für die Screening-Positivität möglicherweise für die Screening-Subpopulationen separat definiert werden, um die falsch-positive Rate für jede einzelne auf niedrigem Niveau zu halten. - Bewertung von Faktoren im Zusammenhang mit dem miRNA-Spiegel in Krebsfällen – insbesondere Krankheitsmerkmale wie Stadium, Grad und verfügbare prognostische Faktoren. Das Verständnis der Natur von Krebs, der mit einem Biomarker erkannt wird, ist ein Schlüsselproblem. Ein Biomarker, der Krebs in einem frühen Stadium erkennt, ist für präventive Zwecke wertvoller als einer, der nur Krebs im Spätstadium erkennt.
• das Vorhandensein von 18 derzeit etablierten Brustkrebsrisiko-SNPs zu bewerten, die durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) erhalten wurden, die gemeinsame Allele mit niedriger Penetranz identifiziert haben, die mit dem Brustkrebsrisiko an mehreren genetischen Loci assoziiert sind, und ihre Assoziation mit zirkulierenden miRNAs, Brustdichte und Screening testen Ergebnis.

Phase 1 – Rekrutierung Etwa 36.600 Frauen (Altersgruppe: 46-67 Jahre), die in ausgewählten Bereichen am BC-Screening-Programm teilnehmen, wird die Teilnahme an der Andromeda-Studie angeboten, von denen 22.000 voraussichtlich eine Einverständniserklärung abgeben. Bei der Einschreibung werden Informationen zu BC-Risikofaktoren und Lebensstil gesammelt, zusammen mit Brustdichte und Blutproben zur Aufbewahrung von Serum, Plasma und Buffy-Coat.

Frauen, die einer Teilnahme an Andromeda zustimmen, werden gebeten, einen Fragebogen zur Bestimmung ihres BC-Standardrisikos und einen detaillierten Fragebogen zu ihrem Lebensstil auszufüllen. Sie werden auch gebeten, eine Blutprobe abzugeben.

Außerdem wird bei der Brustuntersuchung die Brustdichte berechnet. Die Untersuchungen werden von zwei erfahrenen Radiologen gelesen und die Brustdichte wird mithilfe des Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS) in Kategorien eingeteilt.

Frauen, die eine Blutentnahme akzeptieren, erhalten einen speziellen Termin, bei dem geschultes Personal über die Blutentnahme hinaus anthropometrische Messungen sammelt und sie bei Bedarf beim Ausfüllen der Fragebögen der Studie unterstützt.

Da Positivität für dichte Brust, Gail-Score, lebensstilbedingtes Risiko und miRNA bei denselben Probanden bestimmt werden, wird die effizienteste Schätzung des Verhältnisses zwischen relativen (positiven vs. negativen) positiven Vorhersagewerten (PPV) für zwei verschiedene Faktoren angegeben durch a x b/c x d, wobei a = Krebs positiver Faktor 1, aber nicht Faktor 2; b = Frauen mit auffälliger Mammographie, aber ohne Krebs, positiv für Faktor 2, aber nicht für Faktor 1; c=Krebs positiv für Faktor 2 bis aber nicht für Faktor 1; d = Frauen mit auffälliger Mammographie, aber ohne Krebs, positiv für Faktor 1, aber nicht für Faktor 2. Angenommen, 40 % von 21.000 eingeschriebenen Frauen haben eine dichte Brust, 20 % einen bestimmten Gail-Score, 50 % ein Lebensstilrisiko und 20 % eine Vorgabe miRNA, dass 11 % der Frauen in der Studie Brustkrebs haben und dass der Gesamt-PPV der Mammographie 20 % beträgt, werden etwa 100–120 diskordante Krebserkrankungen und 640–740 diskordante Frauen mit auffälliger Mammographie, aber kein Krebs für die betrachteten Faktorenpaare erwartet. Unter diesen Annahmen hat die Studie eine 80%ige Power, die Nullhypothese abzulehnen (Alpha = 0,05), dass das relative PPV-Verhältnis =1 ist, wenn sein wahrer Wert mindestens 1,8-2,0 beträgt, abhängig von den paar berücksichtigten Faktoren.

Phase 2 – Biomarker-Analyse Die Andromeda-Studie umfasst die molekularen Analysen zur Bewertung von SNPs und zirkulierenden miRNAs, die blind an einer geeigneten Fall-Kontroll-Probe durchgeführt werden, die aus der Kohorte der eingeschlossenen Frauen entnommen wird, sobald eine Mindestzahl von BC-Fällen erreicht wird . Durch Verblindung kann vermieden werden, dass die Kenntnis des Ergebnisstatus des Probanden die Interpretation eines Assay-Ergebnisses oder die Sorgfalt, mit der die Probe gehandhabt wird, beeinflusst. Genomische DNA wird mit dem High Pure PCR Template-Vorbereitungskit aus Buffy Coat extrahiert. 18 SNPs werden durch PCR amplifiziert und auf einem qPCR-Gerät mit spezifischen Assays ausgewertet. The 18 breast cancer risk related SNPs are: rs11249433, rs1045485, rs13387042, rs4973768, rs10941679, rs889312, rs2046210, rs13281615, rs1011970, rs2981582, rs2380205, rs10995190, rs704010, rs3817198, rs614367, rs999737, rs3803662 and rs6504950.

Die Extraktion der zirkulierenden Gesamt-RNA aus Plasmaproben wird mit dem miRNeasy-Minikit gemäß dem Exiqon-Protokoll durchgeführt, was die Verwendung eines RNA-Trägers (Batteriofage MS2 RNA, Roche Diagnostics) zur Förderung der RNA-Präzipitation und ihrer Reinigung auf Membranen impliziert. Cel-miR-139 wird zusammen mit hasmiR-1228 als Spike-in-Kontrolle verwendet, um die Extraktionsausbeute zu überprüfen und die Daten zu normalisieren. RNA-Proben werden mit nukleasefreiem Wasser eluiert und bei -80 °C gelagert. Eine neuartige Methode zur Überprüfung auf Hämolyse wird angewendet.

Um die für die zulassungsrelevante Bewertung der Biomarker (ausgedrückt auf einer kontinuierlichen Skala) erforderliche Stichprobengröße zu berechnen, werden minimal akzeptable und wünschenswerte Niveaus typischer Leistungsmaße von Interesse, wie die Richtig-Positiv-Rate (TPR) und die Falsch-Positiv-Rate ( FPR) wurden definiert. Für das allgemeine Bevölkerungsscreening muss die Falsch-Positiv-Rate ziemlich niedrig sein, um zu vermeiden, dass sich einer großen Anzahl von Menschen unnötig kostspielige medizinische Verfahren unterziehen. Daher haben wir eine maximal akzeptable falsch-positive Rate (FPR0) von 4 % (die minimal akzeptable Spezifität beträgt daher 96 %) und eine minimal akzeptable Sensitivität von 80 % (TPR0) angenommen. Die abzulehnende Nullhypothese lautet: H0: TPR0≤0,80 oder FPR0≥0,04.

Die erforderliche Stichprobengröße mit einer Trennschärfe von 80 % (Alpha = 5 %) und unter der Annahme einer wünschenswerten Richtig-Positiv-Rate und Falsch-Positiv-Rate von TPR1 = 0,90 und FPR1 = 0,05, bzw. war von 179 Fällen und 537 Kontrollen. Die Berechnung der Stichprobengröße basierte theoretisch auf der ROC-Kurve. Unter der Annahme einer jährlichen BC-Erkennungsrate (DR) von 0,006 im ersten Jahr und 0,005 im zweiten Jahr der Studie (daher wurde eine zweijährige DR von 0,011 berücksichtigt) werden insgesamt 233 Fallpatienten in den ersten beiden Jahren der Studie erwartet eingehalten werden, wodurch die erforderlichen 179 überschritten werden. Diese Schätzungen basieren auf DRs, die in den Vorjahren in denselben Zentren beobachtet wurden, die in dieser Studie berücksichtigt wurden. Somit werden die molekularen Analysen an 233 Fällen und 699 übereinstimmenden Kontrollen durchgeführt. Für jeden Fall werden drei Kontrollpersonen aus der Frauenkohorte auf der Grundlage der folgenden Kriterien ausgewählt: keine Krebsvorgeschichte, ähnliches Alter bei der Einschreibung (innerhalb von 5 Jahren), ähnliche Rasse, Verfügbarkeit einer Blutprobe, ähnliches Datum der Blutabnahme.