Mutazione di K-RAS, CDKN2A, SMAD4 e TP53 nel carcinoma pancreatico: ruolo della biopsia liquida nella diagnosi preoperatoria

CONTESTO Il cancro del pancreas è la 4a causa di morte correlata al cancro nei paesi occidentali e si prevede che diventerà la 2a principale causa di morte entro il 2030 [1]. Circa l'80% dei pazienti non è resecabile alla diagnosi [2], incluso un 41,4% di pazienti trovati non resecabili alla laparoscopia/tomia esplorativa [3]. Inoltre fino al 38% dei pazienti eventualmente resecati avrà bisogno di una resezione vascolare per ottenere una pancreatectomia radicale [4], poco più della metà dei quali a causa di un'invasione istologica [2]. Ultimo ma non meno importante, i pazienti resecati con successo recidiveranno entro 12 mesi in oltre il 40% dei casi con prognosi infausta [5]. Quei pazienti con recidiva precoce mostreranno una diffusione locale o una malattia metastatica entro 12 mesi con una sopravvivenza post-recidiva e una sopravvivenza globale più che dimezzata rispetto ai pazienti con recidiva oltre un anno dalla resezione [5]. La laparotomia può quindi essere inutile in tali pazienti. In questo contesto il trattamento neoadiuvante gioca un ruolo chiave. Ha i potenziali vantaggi di fornire una terapia sistemica a tutti i pazienti con una maggiore efficacia delle radio e chemioterapie distribuite in un campo vergine, identificare i pazienti con una biologia tumorale aggressiva che potrebbe ripresentarsi poco dopo l'intervento chirurgico e quindi non trarrebbe beneficio da un'operazione. Inoltre la terapia neoadiuvante potrebbe downstadiare il tumore evitando resezioni dei vasi maggiori, diminuire le resezioni dei margini positivi e diminuire le fistole pancreatiche post-operatorie [6]. Sfortunatamente l'imaging non è più affidabile nel predire la resecabilità dopo il trattamento neoadiuvante [7]. Il costo diretto medio totale di un paziente con una malattia resecabile è di $ 134.700, mentre per i pazienti metastatici o non resecabili questo costo è di $ 49.000-65.300 [8]. Un paziente adeguatamente organizzato fornisce una migliore allocazione delle risorse.

La biopsia liquida fornisce una firma non invasiva del tumore, si basa sul materiale genetico circolante proveniente dal turnover cellulare e quindi soprattutto dal tumore [9]. L'analisi delle mutazioni sugli acidi nucleici liberi fornisce informazioni traslazionali sulla biologia del tumore e quindi sulle sue caratteristiche clinico-patologiche e probabilmente sulla sua progressione. La progressione del cancro al pancreas è stata a lungo studiata. Ciò che è chiaro è che le mutazioni attivanti di K-RAS sono un evento precoce nella maggior parte delle lesioni, seguite da mutazioni inattivanti in CDKN2A, TP53 e SMAD4 [10]. Questi 4 geni di montagna sono predittivi del modello di progressione in uno studio autoptico: i pazienti con 2 o meno mutazioni geniche avevano maggiori probabilità di sviluppare un fallimento oligometastatico e di presentare uno stadio precoce della malattia alla diagnosi rispetto a quelli con 3 o più geni mutati [11]. Le mutazioni di K-RAS sono state associate a una sopravvivenza globale peggiore, in particolare se rilevate nel sangue periferico mediante biopsia liquida [12]. Le mutazioni CDKN2A sono state associate all'invasione linfatica e alla diffusa recidiva metastatica [13]. Le mutazioni di TP53 sono state associate a scarsa differenziazione e recidiva locoregionale [13]. Infine mutazioni di SMAD4 sono state associate a invasione della vena porta, invasione perineurale e invasione dei vasi linfatici [14]. Oltre alle prove su quei geni di montagna, c'è un numero crescente di prove di diversi predittori di stadio e prognosi: la sovraespressione della proteina MET è significativamente correlata con l'aumento dello stadio TNM e il peggioramento della sopravvivenza [15]; L'espressione di EDIL3 era significativamente sovraregolata nel PDAC sia nelle linee cellulari che nei campioni clinici e correlata con lo stadio TNM dei pazienti, la classificazione T e i tempi di sopravvivenza globale [16]; La mutazione BRCA1/BRCA2 prevede una sopravvivenza libera da malattia e globale significativamente più breve [17]; L'alta espressione di RAB27A era significativamente associata all'invasione vascolare e allo stadio del tumore [18].

Questi dati sono stati convalidati su campioni del tumore e quindi solitamente su campioni poiché solo il 53,3% delle biopsie ecoguidate fornisce materiale sufficiente per l'istopatologia e/o l'immunoistochimica [19]. Recenti evidenze mostrano che il cancro del pancreas è uno dei 4 tumori, insieme al cancro del colon-retto, gastroesofageo e della mammella, in cui sono presenti livelli rilevabili di ctDNA sia in fase localizzata sia in fase metastatica [20]. Come visto in studi precedenti, la concordanza tra plasma e mutazioni tumorali primarie raggiunge il 100% nel carcinoma pancreatico [9, 21].

Lo studio di tali mutazioni sulla biopsia liquida fornirebbe informazioni non invasive sulla stadiazione preoperatoria e sulla progressione del pattern e quindi una pianificazione terapeutica più accurata.

SCOPO DEL PROGETTO Questo studio è uno studio pilota. I dati genomici saranno descritti insieme alle caratteristiche cliniche della malattia per ciascun paziente.

L'obiettivo primario di questo studio è valutare la relazione delle mutazioni dei principali geni responsabili della progressione del cancro del pancreas (K-RAS, CDKN2A, SMAD4 e TP53) insieme ad altri correlati allo stadio e alla prognosi (MET, BRCA1/BRCA2, EDIL3 e RAB27A) rilevato su sangue periferico e tempo di progressione e invasione vascolare in pazienti sottoposti a pancreatectomia. Altri risultati di interesse saranno le caratteristiche clinicopatologiche e operative come il tempo operatorio, il tipo di resezione vascolare, lo stadio clinico, lo stadio patologico T, N e M, lo stato del margine e la sopravvivenza globale.

MATERIALI E METODO I pazienti con PaC non metastatico sottoposti a resezione pancreatica saranno arruolati dai reparti di chirurgia di un web multicentrico internazionale. I campioni di sangue in EDTA saranno centrifugati a 2300 rpm per 10 minuti due volte. Le biopsie liquide saranno raccolte preoperatoriamente e conservate a -80°. Un database multiparametrico anonimo protetto sarà riempito con tutte le informazioni relative al paziente e alla malattia (sesso, data di nascita, comorbidità, BMI, test di laboratorio, stadio clinico di imaging, tempo di intervento, tipo di intervento, degenza in terapia intensiva, morbilità post-operatoria Dindo-Clavien, stadio patologico, TNM, Grading, ajcc 8° stadio, invasione perineurale, vascolare e linfatica, margini di resezione, sopravvivenza libera da malattia, sopravvivenza globale) e genetica somatica K-RAS, CDKN2A, SMAD4, TP53, MET, BRCA1/BRCA2, RAB27A e EDIL3 mutazioni su biopsia liquida con Next Generation Sequencing (NGS).

Il reclutamento sarà multicentrico: AOU sant'andrea di Roma, Policlinico Universitario Gemelli di Roma, St Vincent University Hospital Dublino, Policlinico Universitario di Modena.

ANALISI STATISTICA La valutazione della relazione tra mutazioni geniche e invasione vascolare sarà effettuata mediante modelli di regressione logistica. Verrà preparato un punteggio complessivo basato sull'arrotondamento dei rapporti log-odds stimati e la sua performance valutata mediante curve ROC e C-statistic.

Verrà inoltre effettuata una valutazione dell'associazione condizionale mediante modelli di regressione logistica multivariata, che saranno selezionati minimizzando il Criterio Informativo di Akaike.

Per valutare gli esiti secondari utilizzeremo anche i modelli di regressione di Cox in modo simile.

Per quanto a nostra conoscenza, esistono informazioni in letteratura riguardanti la frequenza di invasione vascolare nelle pancreatectomie con resezione vascolare (56,7%) e sulle mutazioni dei geni di interesse nell'adenocarcinoma duttale pancreatico (la più bassa frequenza di alleli mutati è del 30% per CDKN2A). Poiché non esiste alcuna ipotesi precedente sulla relazione tra geni e invasione vascolare, e poiché questo studio prevede semplicemente l'analisi di una piccola quantità di sangue che non presenta alcun rischio aggiuntivo per il paziente, abbiamo deciso di eseguire uno studio pilota basato su 50 pazienti. Uno studio completamente pianificato e adeguatamente potenziato sarà quindi condotto sulla base dei risultati di questo studio pilota. La dimensione del campione di 50 è ritenuta abbastanza piccola (considerando, come affermato, l'assenza di rischi aggiuntivi e l'assenza di tecniche invasive) ma abbastanza ampia da garantire che la tabella di contingenza finale non sia sparsa. Tutte le analisi saranno condotte con il software R.

CONCLUSIONI PaC non metastatici rappresentano una sfida nella definizione della stadiazione e della prognosi. Un trattamento su misura per il paziente richiede un'accurata stadiazione preoperatoria. Fino ad oggi oltre il 40% dei pazienti ritenuti resecabili esce dalla sala operatoria senza resezione e un altro 40% dei pazienti resecati recidiva entro un anno. Tra i pazienti ai quali viene proposto un intervento chirurgico, alcuni beneficerebbero di un trattamento neoadiuvante e altri di cure palliative. Questo è il motivo per cui una stadiazione preoperatoria affidabile è essenziale nel processo decisionale terapeutico. I test diagnostici invasivi del pancreas sono costosi e rischiosi a causa della sua posizione retroperitoneale centrale. La biopsia liquida offre una caratterizzazione del tumore non invasiva. Questo studio sarà il primo ad analizzare la relazione dei quattro geni principali, insieme ad altri 5 geni prognostici, coinvolti nella genesi e progressione del cancro del pancreas e nello stadio T con particolare attenzione alla recidiva precoce e all'invasione vascolare, mediante biopsia liquida. Ciò si tradurrà in una migliore allocazione delle risorse, pianificazione del trattamento e risultati per i pazienti.

RIFERIMENTI

1. ricerca sul cancro 2014; 74: 2913-2921
2. Ann Surg Oncol. 2016 giugno;23(6):2028-37
3. Cochrane Database Syst Rev. 2016 Jul 6;7:CD009323
4. J Gastrointest Surg 2004 Dec;8(8):935-49
5. Ann Surg 2018 Mar 23 Epub prima della stampa.
6. J Gastrointest Oncol. 2015 agosto;6(4):418-29.
7. Ann Surg. 7 dicembre 2017 doi: 10.1097/SLA.0000000000002600. [Epub prima della stampa]
8. Cancro. 15 ottobre 2012;118(20):5132-9
9. Scienza 2018 Feb 23:359(6378):926-930.
10. Oncogeno. 7 novembre 2013; 32 (45): 5253-60.
11. Clin Cancer Res 2012 Nov 15;18(22):6229-47.
12. Cancro 2015 Jul 1;121(13):2271-80.
13. Ann Surg 2013 agosto;258(2):336-46.
14. Pancreas 2015 maggio;44(4):660-4.
15. World J Gastroenterol 2014 14 luglio; 20 (26): 8458-70.
16. Oncotarget 2016 Jan 26;7(4):4226-40.
17. J Am Coll Surg 2018 aprile;226(4):630-637.
18. Med Oncol (2015) 32:372.
19. Gastrointest Endosc. 2016 ottobre;84(4):670-8.
20. Sci Transl Med 2014 Feb 19;6(224):224ra24.
21. Proc Natl Acad Sci U S A 2017 Sep 19;114(38):10202-10207.