Mutação de K-RAS, CDKN2A, SMAD4 e TP53 no Câncer de Pâncreas: Papel da Biópsia Líquida no Diagnóstico Pré-operatório

ANTECEDENTES O cancro do pâncreas é a 4ª causa de morte relacionada com o cancro nos países ocidentais e espera-se que se torne a 2ª principal causa de morte até 2030 [1]. Aproximadamente 80% dos pacientes são irressecáveis ​​no momento do diagnóstico [2], incluindo 41,4% dos pacientes considerados irressecáveis ​​na laparoscopia exploratória/tomia [3]. Além disso, até 38% dos pacientes eventualmente ressecados precisarão de uma ressecção vascular para obter uma pancreatectomia radical [4], pouco mais da metade dos quais devido a uma invasão histológica [2]. Por último, mas não menos importante, os pacientes ressecados com sucesso irão recorrer dentro de 12 meses em mais de 40% dos casos com prognóstico sombrio [5]. Esses pacientes recorrentes precoces apresentarão disseminação local ou doença metastática dentro de 12 meses, com sobrevida pós-recorrência e sobrevida global mais da metade em comparação com pacientes recorrentes além de um ano da ressecção [5]. A laparotomia pode, portanto, ser inútil em tais pacientes. Neste cenário, o tratamento neoadjuvante desempenha um papel fundamental. Tem as vantagens potenciais de fornecer terapia sistêmica a todos os pacientes com maior eficácia de rádio e quimioterapia distribuída em um campo virgem, identificar pacientes com biologia tumoral agressiva que podem recorrer logo após a cirurgia e, portanto, não se beneficiariam de uma operação. Além disso, a terapia neoadjuvante poderia diminuir o tumor evitando ressecções de grandes vasos, diminuir ressecções de margens positivas e diminuir fístulas pancreáticas pós-operatórias [6]. Infelizmente, a imagem não é mais confiável para prever a ressecabilidade após o tratamento neoadjuvante [7]. O custo direto médio total de um paciente com doença ressecável é de US$ 134.700, enquanto para pacientes metastáticos ou irressecáveis ​​esse custo é de US$ 49.000-65.300 [8]. Um paciente devidamente estadiado proporciona uma melhor alocação de recursos.

A biópsia líquida fornece uma assinatura não invasiva do tumor, é baseada em material genético circulante proveniente do turnover celular e, portanto, especialmente do tumor [9]. A análise de mutações em ácidos nucleicos livres de células fornece informações translacionais sobre a biologia do tumor e, portanto, sobre suas características clínico-patológicas e provavelmente sobre sua progressão. A progressão do câncer de pâncreas tem sido estudada há muito tempo. O que está claro é que as mutações ativadoras de K-RAS são um evento precoce na maioria das lesões, seguidas por mutações inativadoras em CDKN2A, TP53 e SMAD4 [10]. Esses 4 genes da montanha são preditivos do padrão de progressão em um estudo autóptico: pacientes com 2 ou menos mutações genéticas eram mais propensos a desenvolver falha oligometastática e abrigar estágio inicial da doença no diagnóstico em comparação com aqueles com 3 ou mais genes mutados [11]. As mutações do K-RAS têm sido associadas a uma pior sobrevida global, principalmente quando encontradas no sangue periférico por biópsia líquida [12]. Mutações de CDKN2A têm sido associadas à invasão linfática e recorrência metastática generalizada [13]. As mutações TP53 têm sido associadas a uma diferenciação deficiente e recorrência locorregional [13]. Finalmente, as mutações SMAD4 foram associadas à invasão da veia porta, invasão perineural e invasão de vasos linfáticos [14]. Além das evidências sobre esses genes da montanha, há um crescente corpo de evidências de vários preditores de estágio e prognóstico: a superexpressão da proteína MET significativamente correlacionada com aumento do estágio TNM e piora da sobrevida [15]; A expressão de EDIL3 foi significativamente aumentada em PDAC em ambas as linhagens de células e amostras clínicas e correlacionada com o estágio TNM dos pacientes, classificação T e tempos de sobrevida global [16]; A mutação BRCA1/BRCA2 prevê uma sobrevida livre de doença e uma sobrevida global significativamente mais curtas [17]; A alta expressão de RAB27A foi significativamente associada à invasão vascular e ao estágio do tumor [18].

Esses dados foram validados em amostras do tumor e, portanto, geralmente em espécimes, pois apenas 53,3% das biópsias guiadas por ultrassom fornecem material suficiente para histopatologia e/ou imuno-histoquímica [19]. Evidências recentes mostram que o câncer pancreático é um dos 4 tipos de câncer, junto com o câncer colorretal, gastroesofágico e de mama, nos quais os níveis detectáveis ​​de ctDNA estão presentes tanto em estágios localizados quanto metastáticos [20]. Como visto em estudos anteriores, a concordância entre o plasma e as mutações do tumor primário chega a 100% no câncer pancreático [9, 21].

O estudo dessas mutações na biópsia líquida forneceria informações não invasivas sobre o estadiamento pré-operatório e a progressão do padrão e, portanto, um planejamento terapêutico mais preciso.

OBJETIVO DO PROJETO Este estudo é um estudo piloto. Os dados genômicos serão descritos juntamente com as características clínicas da doença para cada paciente.

O objetivo primário deste estudo é avaliar a relação das mutações dos principais genes responsáveis ​​pela progressão do câncer pancreático (K-RAS, CDKN2A, SMAD4 e TP53) juntamente com outros relacionados ao estágio e prognóstico (MET, BRCA1/BRCA2, EDIL3 e RAB27A) detectado no sangue periférico e tempo de progressão e invasão vascular em pacientes submetidos à pancreatectomia. Outros desfechos de interesse serão características clínico-patológicas e operatórias, como tempo operatório, tipo de ressecção vascular, estágio clínico, estágio patológico T, N e M, status de margem e sobrevida geral.

MATERIAIS E MÉTODOS Os pacientes com PaC não metastático submetidos à ressecção pancreática serão inscritos nos departamentos de cirurgia de uma rede internacional multicêntrica. As amostras de sangue em EDTA serão centrifugadas a 2300 rpm por 10min duas vezes. As biópsias líquidas serão coletadas no pré-operatório e armazenadas a -80°. Um banco de dados multiparamétrico anônimo protegido será preenchido com todas as informações relevantes do paciente e da doença (sexo, data de nascimento, comorbidades, IMC, exames laboratoriais, estágio clínico de imagem, tempo de operação, tipo de operação, permanência na UTI, morbidade pós-operatória de Dindo-Clavien, estágio patológico, TNM, Grading, ajcc 8º estágio, invasão perineural, vascular e linfática, margens de ressecção, sobrevida livre de doença, sobrevida global) e K-RAS, CDKN2A, SMAD4, TP53, MET, BRCA1/BRCA2, RAB27A e EDIL3 genético somático mutações em biópsia líquida com Next Generation Sequencing (NGS).

O recrutamento será multicêntrico: AOU sant'andrea di Roma, Policlinico Universitario Gemelli di Roma, St Vincent University Hospital Dublino, Policlinico Universitario di Modena.

ANÁLISE ESTATÍSTICA A avaliação da relação entre mutações gênicas e invasão vascular será realizada por meio de modelos de regressão logística. Um escore global será elaborado com base no arredondamento das razões log-odds estimadas e seu desempenho avaliado por meio de curvas ROC e estatística-C.

Uma avaliação da associação condicional também será realizada por meio de modelos de regressão logística multivariada, que serão selecionados minimizando o Critério de Informação de Akaike.

Para avaliar resultados secundários, também usaremos modelos de regressão de Cox de maneira semelhante.

Até onde sabemos, há informações na literatura sobre a frequência de invasão vascular em pancreatectomias com ressecção vascular (56,7%) e sobre mutações dos genes de interesse no adenocarcinoma ductal pancreático (a menor frequência do alelo mutante sendo 30% para CDKN2A). Como não há hipótese prévia sobre a relação entre genes e invasão vascular, e como este estudo envolve apenas a análise de uma pequena quantidade de sangue sem oferecer risco adicional para o paciente, decidimos fazer um estudo piloto com 50 pacientes. Um estudo totalmente planejado e com poder adequado será então conduzido com base nos resultados deste estudo piloto. O tamanho amostral de 50 é considerado pequeno o suficiente (considerando, como dito, a ausência de risco adicional e o não uso de técnicas invasivas), mas grande o suficiente para garantir que a tabela de contingência final não seja esparsa. Todas as análises serão realizadas com o software R.

CONCLUSÕES As PaC não metastáticas representam um desafio no estadiamento e na definição do prognóstico. Um tratamento personalizado ao paciente requer um estadiamento pré-operatório preciso. Até agora, mais de 40% dos pacientes considerados ressecáveis ​​saem da sala de cirurgia sem ressecção e outros 40% dos pacientes ressecados recorrem dentro de um ano. Entre os pacientes aos quais é oferecida uma cirurgia, alguns se beneficiariam de um tratamento neoadjuvante e outros de tratamentos paliativos. É por isso que um estadiamento pré-operatório confiável é essencial na tomada de decisões terapêuticas. Testes diagnósticos invasivos do pâncreas são caros e arriscados devido à sua localização retroperitoneal central. A biópsia líquida oferece uma caracterização tumoral não invasiva. Este estudo será o primeiro a analisar a relação dos quatro genes principais, juntamente com outros 5 genes prognósticos, envolvidos na gênese e progressão do câncer pancreático e estágio T com atenção especial para recorrência precoce e invasão vascular, por biópsia líquida. Isso resultará em uma melhor alocação de recursos, planejamento do tratamento e resultados dos pacientes.

REFERÊNCIAS

1. Res. de Câncer 2014; 74: 2913-2921
2. Ann Surg Oncol. 2016 jun;23(6):2028-37
3. Cochrane Database Syst Rev. 2016 Jul 6;7:CD009323
4. J Gastrointestinal Surg 2004 dez;8(8):935-49
5. Ann Surg 2018 Mar 23 Epub antes da impressão.
6. J Gastrointestinal Oncol. 2015 ago;6(4):418-29.
7. Ana Cirurg. 7 de dezembro de 2017. doi: 10.1097/SLA.0000000000002600. [Epub antes da impressão]
8. Câncer. 15 de outubro de 2012;118(20):5132-9
9. Science 2018 Feb 23:359(6378):926-930.
10. Oncogene. 7 de novembro de 2013;32(45):5253-60.
11. Clin Cancer Res 2012 Nov 15;18(22):6229-47.
12. Câncer 1 de julho de 2015;121(13):2271-80.
13. Ann Surg 2013 agosto;258(2):336-46.
14. Pâncreas maio de 2015;44(4):660-4.
15. World J Gastroenterol 2014 Jul 14;20(26):8458-70.
16. Oncotarget 2016 Jan 26;7(4):4226-40.
17. J Am Coll Surg 2018 abril;226(4):630-637.
18. Med Oncol (2015) 32:372.
19. Gastrointestinal Endosc. 2016 out;84(4):670-8.
20. Sci Transl Med 2014 Feb 19;6(224):224ra24.
21. Proc Natl Acad Sci U S A 2017 Set 19;114(38):10202-10207.