Hypiend - Intervento Comportamentale Multicomponente nei Bambini Prepuberi (Hypiend-PPC) (Hypiend-PPC)

1. CONTESTO E GIUSTIFICAZIONE

   1.1. AMBITO E VALUTAZIONE DELLE CONOSCENZE ATUALI DIRETTAMENTE CORRELATE ALLE DOMANDE SCIENTIFICHE DA RISOLVERE NELLO STUDIO CLINICO Diversi studi epidemiologici hanno identificato preoccupanti legami tra un'elevata esposizione agli EDC e effetti negativi sulla salute di bambini e adolescenti. Come esempio illustrativo, nell'ambito del progetto Human Biomonitoring for Europe (HBM4EU), Lange et al. (2022) hanno analizzato la valutazione del rischio di esposizione combinata a ftalati anti-androgeni (Di(2-etilesil) ftalato (DEHP), Di-isobutil ftalato (DiBP), Di-n-butil ftalato (DnBP), Butil benzil ftalato (BBzP) e Di-isononil ftalato (DiNP) in bambini (6-11 anni) e adolescenti (12-18 anni) di diversi paesi europei. Gli autori hanno riportato che DnBP e DiBP sono stati identificati come i principali fattori dell'aumento dell'indice di pericolo (HI) di una miscela di ftalati in un'ampia coorte di bambini e adolescenti europei. È interessante notare, tuttavia, che per il 63% di questi soggetti che avevano un HI > 1, questo rischio non sarebbe stato rilevato se il rischio per ciascuna sostanza chimica fosse stato analizzato individualmente, illustrando l'importanza di condurre analisi di valutazione del rischio per le miscele. Inoltre, gli autori hanno riscontrato differenze nell'HI legato all'esposizione tra le regioni europee, con bambini e adolescenti delle regioni orientali più esposti di quelli del sud e dell'ovest, sottolineando l'importanza di includere paesi con diversi gradi di esposizione per ottenere conclusioni più olistiche e implementare misure, politiche e raccomandazioni adattate. Diversi studi epidemiologici hanno suggerito che l'aumento dell'esposizione agli EDC con attività ormonale negli ultimi decenni, in particolare a sostanze con attività estrogenica diretta, potrebbe essere tra le cause attribuite all'aumento osservato nell'insorgenza della pubertà in ragazze e ragazzi nei paesi sviluppati. A questo proposito, uno studio trasversale molto recente su 1539 bambini spagnoli ha rilevato che concentrazioni più elevate di alcuni pesticidi non persistenti erano associate a una maggiore probabilità di sviluppare una pubertà precoce sia nei ragazzi che nelle ragazze, e che questa associazione dipendeva dall'indice di massa corporea (BMI) del bambino.

   Per quanto ne sanno i ricercatori, i dati sugli EDC finalizzati a ridurre l'esposizione a queste sostanze nei bambini prepuberi sono molto scarsi e inconcludenti, inclusa la maggior parte di essi con meno di 100 bambini, analizzando al massimo due diverse famiglie di EDC e mancando di un gruppo di controllo.

   HYPIEND mira a valutare se un intervento controllato multicentrico e multicomponente (implementazione di una mensa scolastica senza plastica nella scuola elementare + programma educativo scolastico per bambini + laboratori per genitori + applicazione mobile per genitori progettata per limitare l'esposizione agli EDC) condotto nelle scuole primarie su bambini prepuberi sia in grado di ridurre le concentrazioni urinarie di diversi EDC e se questo possa prevenire l'insorgenza precoce della fase puberale associata a un'elevata esposizione agli EDC. Inoltre, verranno valutate anche diverse misure antropometriche. Gli effetti saranno confrontati con un gruppo di intervento di controllo, che riceverà solo laboratori placebo con informazioni sui pericoli degli schermi, i benefici dell'attività fisica e l'importanza di buone abitudini di sonno. L'intervento sarà implementato per due anni e mezzo scolastici consecutivi (da novembre 2025 (inizio dell'intervento) a dicembre 2027) e terrà conto di appropriate tecniche e modelli di cambiamento comportamentale per ottenere un'elevata aderenza all'intervento.

   Le scuole saranno reclutate da diverse zone ambientali (rurali e urbane) per tenere conto di diverse esposizioni a contaminanti ambientali. I ricercatori valuteranno la concentrazione di biomarcatori di esposizione a diverse famiglie di EDC nelle urine dei bambini in tre momenti diversi (al basale e alla fine del primo e del terzo anno scolastico). Verrà eseguita una valutazione del rischio dell'esposizione agli EDC, includendo tutti i dati ottenuti nelle urine in diversi momenti. Inoltre, saranno condotte analisi multivariate per esplorare la possibilità di determinare l'esposizione agli EDC attraverso variabili predittive, come abitudini alimentari, abitudini comportamentali legate all'esposizione agli EDC, ambiente scolastico e stato socioeconomico. Infine, lo studio sarà condotto in due diversi paesi (Belgio e Spagna). Nel complesso, questo approccio contribuirà a ottenere un quadro più accurato dell'esposizione agli EDC e del grado di riduzione dell'esposizione agli EDC in risposta all'intervento implementato, tenendo conto di diversi importanti fattori coinvolti nel carico correlato agli EDC.

   1.2. RISULTATI DI STUDI CLINICI COMPLETATI E NUMERO DI STUDI CLINICI IN CORSO CHE UTILIZZANO LO STESSO INTERVENTO NELLA STESSA INDICAZIONE.

   Recentemente, Sessa et al. (2021) hanno dimostrato che un intervento nella mensa scolastica (implementazione di un servizio senza plastica) per 5 giorni alla settimana per 6 mesi ha ridotto significativamente i livelli urinari di bisfenolo A tra i gruppi e anche all'interno del gruppo iscritto alla mensa scolastica senza plastica. Tuttavia, sono necessari studi MBI più ampi che coinvolgano scuole e anche famiglie, con il supporto di esperti in cambiamento comportamentale e scienze dell'educazione, per promuovere effetti duraturi, al fine di minimizzare l'esposizione complessiva a diversi EDC in modo più conclusivo.

   1.3. LIVELLO DI EVIDENZA RELATIVO AL MECCANISMO D'AZIONE DELL'INTERVENTO NELLA POPOLAZIONE CLINICA PREVISTA PER LO STUDIO.

   EDC-Mix-Risk e ENDpoiNTs sono due eccezionali progetti Horizon 2020 che hanno combinato ricerca sperimentale sia in cellule che in animali con dati epidemiologici. I ricercatori di entrambi i progetti e altri hanno dimostrato molto bene, utilizzando un modello statistico per la regressione multivariata con dati ottenuti nello studio di gravidanza SELMA, che diversi EDC (inclusi ftalati, alchilfenoli e sostanze perfluoroalchiliche) analizzati nelle urine o nel siero di donne alla settimana 10 di gravidanza erano associati a ritardo del linguaggio nei bambini a 2,5 anni di età. Successivamente, gli EDC identificati sono stati miscelati e testati in organoidi cerebrali umani, nonché in Xenopus leavis e Danio rerio per chiarire l'impatto molecolare e funzionale dell'esposizione. Infine, gli autori hanno integrato dati sperimentali ed epidemiologici e condotto un approccio di valutazione del rischio, trovando un aumento delle probabilità di ritardo del linguaggio fino al 54% della prole che aveva esposizioni prenatali superiori ai livelli di preoccupazione derivati sperimentalmente. Nonostante questi risultati altamente rilevanti, un numero limitato di studi umani ha fatto luce sui meccanismi alla base delle disfunzioni mediate dagli EDC nell'asse HPA, inclusa l'induzione di cambiamenti epigenetici in geni chiave coinvolti nella regolazione neuroendocrina e nella pubertà precoce, nonché alterazioni nella risposta infiammatoria e nel microbiota intestinale (disbiosi). Gli EDC possono aumentare il rischio di disturbi del neurosviluppo nei bambini interferendo con la segnalazione o il metabolismo degli estrogeni e degli ormoni tiroidei nella prima infanzia. Molto recentemente è stato dimostrato che l'aumento dei livelli urinari di una miscela di diverse sostanze chimiche ambientali (fenoli, metalli tossici e pesticidi non persistenti) misurati in adolescenti di 15-17 anni era associato a livelli circolanti più elevati di proteina kiss54 e livelli più bassi di metilazione in diversi Citosina-fosfato-Guanina (CpG) nel gene kiss1. Inoltre, gli adolescenti che mostravano kiss54 sierica più elevata avevano livelli più alti di ormone luteinizzante (LH), e le percentuali di metilazione CpG1, CpG2 e totale CpG del terzo tertile erano associate a livelli più bassi di ormone follicolo-stimolante (FSH) ed estradiolo (E2). Questi risultati suggeriscono che le proteine kiss, che è un peptide neuroattivo derivato da un precursore (pro-ormone, pre-pro-kisspeptina) rilasciato dai neuroni nell'ipotalamo, potrebbero essere un promettente biomarcatore dell'effetto delle miscele di sostanze chimiche ambientali sul profilo ormonale riproduttivo. Tuttavia, nonostante queste evidenze, per quanto ne sanno i ricercatori, nessuno studio di intervento umano finalizzato a ridurre l'esposizione agli EDC ha analizzato l'impatto molecolare che potrebbe accompagnare questi cambiamenti nell'esposizione agli EDC. Sono necessarie ulteriori ricerche per far più luce su queste questioni, incluse analisi molecolari e omiche nell'uomo per chiarire se gli studi di intervento umano finalizzati a ridurre l'esposizione agli EDC siano in grado di modulare favorevolmente questi cambiamenti molecolari.

   In questo progetto, verranno condotti diversi approcci molecolari e omici per far più luce, nel quadro dell'asse HPA, sui driver epigenetici più suscettibili all'alterazione e sull'interazione tra microbiota intestinale e l'impatto dell'esposizione agli EDC sull'infiammazione sistemica. Queste analisi saranno eseguite su campioni ottenuti nello studio tenendo conto dei risultati ottenuti in modelli preclinici esposti a miscele di EDC che tentano di mimare la reale esposizione umana, per aumentare le possibilità di ottenere risultati robusti e affidabili utilizzando un approccio mirato. Specificamente, nei bambini prepuberi, oltre al microbiota intestinale, i ricercatori valuteranno anche gli ormoni correlati all'asse HPA, la metilazione di diversi siti CpG di geni chiave coinvolti nell'asse HPA e i livelli circolanti di kisspeptina utilizzando gocce di sangue essiccate. Nel complesso, queste analisi ci permetteranno di approfondire i meccanismi attraverso i quali gli EDC esercitano i loro effetti dannosi, nonché come gli studi di intervento finalizzati a ridurre l'esposizione a queste sostanze chimiche possano modulare queste vie biologiche e i biomarcatori molecolari di esposizione identificati. Per quanto ne sanno i ricercatori, questo approccio non è stato ancora effettuato in ampi studi di intervento umano nel contesto degli EDC.

   1.4. PROGETTO HYPIEND L'intervento presentato qui fa parte del Progetto Europeo HYPIEND. Questo progetto è coordinato dal Centro Tecnologico della Catalogna (Eurecat), finanziato dal programma quadro Horizon Europe (ID accordo di sovvenzione: 101137440).

   Il progetto HYPIEND indaga gli effetti dell'esposizione a multipli EDC sulla funzione e sulla programmazione epigenetica dell'asse HPA per delineare strategie di intervento per minimizzare l'esposizione e le conseguenze sul sistema neuroendocrino durante le fasi perinatale e prepuberale.

   Il consorzio multidisciplinare HYPIEND è composto da 14 partner di otto paesi europei. Tra di essi: Stichting Radboud Universiteit (Paesi Bassi), Institut de Investigació en Ciencies de la Salut Germans Trias i Pujol (Spagna), Sciensano (Belgio), Kungliga Tekniska Hoegskolan (Svezia), Katholieke Universiteit Leuven (Belgio), University of Granada (Spagna), Centrum Medyczne Ksztalcenia Podyplomowego (Polonia), Protoqsar 2000 sl (Spagna), Enco srl (Italia), Fundacion para la investigacion del hospital universitario la Fe de la Comunidad Valenciana (Spagna), Université de Liège (Belgio), Universite de Geneve (Svizzera), King's College London (UK).

   Ulteriori informazioni su questo progetto possono essere trovate ai seguenti link: https://hypiend.eu/ Ecco una panoramica della metodologia Hypiend. I dati dei database pubblici saranno combinati per sviluppare una base di conoscenza che colleghi l'esposizione selezionata agli EDC agli esiti di salute correlati all'asse HPA. Le metodologie di relazione quantitativa struttura-attività (QSAR) saranno combinate con l'analisi dei dati per identificare modelli di co-esposizione. Le miscele di EDC con alta prevalenza nelle popolazioni target saranno definite, sia qualitativamente che quantitativamente, secondo i modelli di coesposizione. Le miscele candidate di EDC saranno testate in modelli basati su cellule per definire modelli dose-risposta e dosaggi per studi successivi. I modelli di zebrafish che ricapitolano gli assi HP saranno utilizzati per selezionare quelle miscele di EDC con il maggiore impatto. Successivamente, le miscele selezionate di EDC saranno testate in modelli di placenta e BHE per valutare la diffusione delle miscele di EDC e caratterizzare le frazioni che raggiungono sia il feto che l'ipotalamo. Gli effetti sullo sviluppo e la funzione dell'ipotalamo e della ghiandola pituitaria saranno valutati in organoidi derivati da cellule staminali e OoC, con particolare attenzione agli effetti sulla metilazione del DNA dell'intero genoma e sulla funzionalità ormonale. I risultati saranno utilizzati per selezionare ulteriormente miscele complesse di EDC secondo la loro programmazione epigenetica HP e il potenziale di disturbo. Successivamente, gli animali da laboratorio saranno esposti a miscele di EDC dalla gestazione alla prima generazione per valutare gli effetti di programmazione e cumulativi dell'esposizione agli EDC sull'asse HPA. Gli esiti fisiologici e comportamentali della disfunzione HP saranno monitorati. In parallelo, saranno determinati gli effetti sulla metilazione del DNA di ipotalamo, ghiandola pituitaria e cellule del sangue periferico, nonché i cambiamenti in specifiche ECV circolanti. Un approccio di biologia dei sistemi basato sull'IA sarà utilizzato per descrivere associazioni tra funzione ipotalamo/ghiandola pituitaria, modelli di metilazione delle cellule del sangue ematoperiferiche e dati multiomici. Queste associazioni saranno utilizzate per stabilire firme specifiche associate alla disfunzione HP da esposizione agli EDC. Le firme saranno esplorate in campioni della popolazione target (cioè bambini nei loro primi 1000 giorni e prepuberi) per esplorare la loro traslabilità e applicazione come biomarcatori. Gli studi umani non saranno limitati a determinazioni trasversali, ma sono intesi come nuovi interventi per promuovere la diminuzione dell'esposizione agli EDC e per valutare la relazione causa-effetto. Questo permetterà la definizione di biomarcatori basati su dati ottenuti dai diversi pacchetti di lavoro e un approccio di biologia dei sistemi per svelare meccanismi d'azione conservati.

   Il lavoro è stato proposto come una sequenza di compiti finalizzati a definire l'impatto della co-esposizione realistica agli EDC sull'asse HPA di due fasi di vita target, cioè prepuberale e perinatale. I diversi livelli proposti da organizzazioni come l'OCSE, inclusi i NAM e la tossicologia computazionale, sono stati adottati per minimizzare la ricerca animale. Questo design combina ricerca traslazionale con studi di intervento.

2. IPOTESI O DOMANDA DI STUDIO Un MBI nelle scuole primarie di due paesi europei (Spagna e Belgio) per 28 mesi ridurrà i livelli urinari di EDC nei bambini prepuberi e aumenterà la conoscenza su questi contaminanti.
3. OBIETTIVI

3.1. OBIETTIVO PRINCIPALE L'obiettivo generale di HYPIEND è comprendere gli effetti della co-esposizione agli EDC sulla funzione e sulla programmazione epigenetica dell'asse HPA al fine di delineare strategie di intervento per minimizzare l'esposizione e le conseguenze neuroendocrine durante le fasi perinatale e prepuberale.

In questo quadro, l'obiettivo principale dello studio clinico è dimostrare che un MBI implementato nelle scuole primarie di due diversi paesi europei durante 25 mesi è efficace nel ridurre i livelli urinari di EDC dei bambini prepuberi utilizzando i costrutti HAPA per migliorare l'intervento e la conoscenza su questi contaminanti dei loro genitori, nonché per approfondire la conoscenza scientifica.

3.2. OBIETTIVI SECONDARI

1. Determinare se un intervento progettato per ridurre l'esposizione agli EDC possa prevenire alcuni degli effetti deleteri correlati all'HP alterato in bambini prepuberi di età compresa tra 6 e 8 anni (insorgenza precoce della fase puberale e alterazioni nel BMI e nella funzione cognitiva).
2. Comprendere meglio la relazione tra livelli urinari di EDC e livelli ormonali correlati all'HP, nonché modelli di metilazione del DNA e composizione del microbiota intestinale, facendo più luce sui meccanismi attraverso i quali gli EDC possono esercitare i loro effetti deleteri.
3. Esplorare, mediante analisi multivariata e analisi di valutazione del rischio, predittori di livelli urinari elevati di EDC.
4. Determinare se un intervento basato sui modelli combinati HAPA1 e PBS2 nelle scuole primarie sia efficace nel migliorare i costrutti HAPA, la conoscenza e il comportamento di genitori, bambini e team educativi verso questi inquinanti, rispetto a un intervento placebo.