Hypiend - Intervenção Comportamental Multicomponente em Crianças Pré-púberes (Hypiend-PPC) (Hypiend-PPC)

1. FUNDAMENTAÇÃO E JUSTIFICAÇÃO

   1.1. ÂMBITO E AVALIAÇÃO DO CONHECIMENTO ATUAL DIRETAMENTE RELACIONADO COM AS QUESTÕES CIENTÍFICAS A RESPONDER NO ESTUDO CLÍNICO Vários estudos epidemiológicos identificaram ligações preocupantes entre a elevada exposição a EDCs e efeitos adversos na saúde de crianças e adolescentes. Como exemplo ilustrativo, no âmbito do projeto Human Biomonitoring for Europe (HBM4EU), Lange et al. (2022) analisaram a avaliação de risco da exposição combinada a ftalatos antiandrogénicos (Di(2-etilhexil) ftalato (DEHP), Di-isobutil ftalato (DiBP), Di-n-butil ftalato (DnBP), Butil benzil ftalato (BBzP) e Di-isononil ftalato (DiNP)) em crianças (6-11 anos) e adolescentes (12-18 anos) de diferentes países europeus. Os autores relataram que o DnBP e o DiBP foram identificados como os principais impulsionadores do aumento do índice de perigo (HI) de uma mistura de ftalatos numa grande coorte de crianças e adolescentes europeus. Curiosamente, no entanto, para 63% destes sujeitos que tinham um HI > 1, este risco não teria sido detetado se o risco de cada químico tivesse sido analisado individualmente, ilustrando a importância de realizar análises de avaliação de risco de misturas. Além disso, os autores encontraram diferenças no HI relacionado com a exposição entre regiões europeias, com crianças e adolescentes nas regiões orientais a estarem mais expostos do que os do sul e oeste, destacando a importância de incluir países com diferentes graus de exposição para obter conclusões mais holísticas e implementar medidas, políticas e recomendações adaptadas. Diferentes estudos epidemiológicos sugeriram que o aumento da exposição a EDCs com atividade hormonal nas últimas décadas, especialmente a substâncias com atividade estrogénica direta, poderá estar entre as causas atribuídas ao aumento observado no início da puberdade em raparigas e rapazes em países desenvolvidos. A este respeito, um estudo transversal muito recente com 1539 crianças espanholas descobriu que concentrações mais elevadas de certos pesticidas não persistentes estavam associadas a uma maior probabilidade de desenvolver puberdade precoce tanto em rapazes como em raparigas, e que esta associação dependia do índice de massa corporal (IMC) da criança.

   Até ao conhecimento dos investigadores, existem dados muito escassos e inconclusivos sobre EDCs destinados a reduzir a exposição a estas substâncias em crianças pré-púberes, incluindo a maioria com menos de 100 crianças, analisando no máximo duas famílias diferentes de EDCs e sem grupo de controlo.

   O HYPIEND visa avaliar se uma intervenção controlada multicêntrica e multicomponente (implementação de refeitório sem plástico na escola primária + programa educativo escolar para crianças + workshops para pais + aplicação móvel para pais concebida para limitar a exposição a EDCs) realizada em escolas primárias em crianças pré-púberes é capaz de reduzir as concentrações urinárias de diferentes EDCs e se isto pode prevenir o início mais precoce da fase pubertária associada à elevada exposição a EDCs. Além disso, diferentes medidas antropométricas também serão avaliadas. Os efeitos serão comparados com um grupo de controlo de intervenção, que receberá apenas workshops placebo com informação sobre os perigos dos ecrãs, os benefícios da atividade física e a importância de bons hábitos de sono. A intervenção será implementada ao longo de dois anos e meio letivos consecutivos (de novembro de 2025 (início da intervenção) a dezembro de 2027) e considerará técnicas e modelos apropriados de mudança de comportamento para alcançar alta adesão à intervenção.

   As escolas serão recrutadas de diferentes zonas ambientais (rurais e urbanas) para contabilizar diferentes exposições a contaminantes ambientais. Os investigadores avaliarão a concentração de biomarcadores de exposição a diferentes famílias de EDCs na urina das crianças em três momentos diferentes (no início e no final do primeiro e terceiro ano letivo). Será realizada uma avaliação de risco da exposição a EDCs, incluindo todos os dados obtidos na urina em diferentes momentos. Além disso, serão realizadas análises multivariadas para explorar a possibilidade de determinar a exposição a EDCs através de variáveis preditivas, como hábitos alimentares, hábitos comportamentais relacionados com a exposição a EDCs, ambiente escolar e estatuto socioeconómico. Finalmente, o estudo será realizado em dois países diferentes (Bélgica e Espanha). No geral, esta abordagem contribuirá para obter uma imagem mais precisa da exposição a EDCs e do grau de redução da exposição a EDCs em resposta à intervenção implementada, tendo em conta diferentes fatores importantes envolvidos na carga relacionada com EDCs.

   1.2. RESULTADOS DE ESTUDOS CLÍNICOS CONCLUÍDOS E NÚMERO DE ESTUDOS CLÍNICOS EM CURSO UTILIZANDO A MESMA INTERVENÇÃO NA MESMA INDICAÇÃO.

   Recentemente, Sessa et al. (2021) demonstraram que uma intervenção no refeitório escolar (implementação de um serviço sem plástico) durante 5 dias por semana durante 6 meses diminuiu significativamente os níveis urinários de bisfenol A entre os grupos e também dentro do grupo inscrito no refeitório escolar sem plástico. No entanto, são necessários estudos MBI maiores envolvendo escolas e também famílias, com o apoio de especialistas em mudança de comportamento e ciências da educação, para promover efeitos duradouros, de modo a minimizar a exposição global a diferentes EDCs de forma mais conclusiva.

   1.3. NÍVEL DE EVIDÊNCIA RELACIONADO COM O MECANISMO DE AÇÃO DA INTERVENÇÃO NA POPULAÇÃO DO ESTUDO CLÍNICO PLANEADO.

   EDC-Mix-Risk e ENDpoiNTs são dois projetos notáveis do Horizonte 2020 que combinaram investigação experimental em células e animais com dados epidemiológicos. Investigadores de ambos os projetos e outros demonstraram muito bem, utilizando um modelo estatístico para regressão multivariada com dados obtidos no estudo de gravidez SELMA, que diferentes EDCs (incluindo ftalatos, alquilfenóis e substâncias perfluoroalquílicas) analisados na urina ou soro de mulheres na semana 10 de gravidez estavam associados a atraso na linguagem em crianças aos 2,5 anos de idade. Posteriormente, os EDCs identificados foram misturados e testados em organoides cerebrais humanos, bem como em Xenopus leavis e Danio rerio para elucidar o impacto molecular e funcional da exposição. Finalmente, os autores integraram dados experimentais e epidemiológicos e realizaram uma abordagem de avaliação de risco, encontrando um aumento das probabilidades de atraso na linguagem em até 54% dos descendentes que tiveram exposições pré-natais acima dos níveis de preocupação derivados experimentalmente. Apesar destas descobertas altamente relevantes, um número limitado de estudos em humanos esclareceu os mecanismos subjacentes às disfunções mediadas por EDCs no eixo HPA, incluindo a indução de alterações epigenéticas em genes-chave envolvidos na regulação neuroendócrina e puberdade precoce, bem como alterações na resposta inflamatória e microbiota intestinal (disbiose). Os EDCs podem aumentar o risco de perturbações do neurodesenvolvimento em crianças ao interferirem com a sinalização ou metabolismo das hormonas estrogénicas e da tiroide no início da vida. Muito recentemente, foi demonstrado que o aumento dos níveis urinários de uma mistura de diferentes químicos ambientais (fenóis, metais tóxicos e pesticidas não persistentes) medidos em adolescentes com idades entre 15-17 anos estava associado a níveis circulantes mais elevados da proteína kiss54 e níveis mais baixos de metilação em diferentes Citosina-fosfato-Guanina (CpGs) no gene kiss1. Além disso, adolescentes que mostraram kiss54 sérica mais elevada tinham níveis mais elevados de Hormona Luteinizante (LH), e os percentuais de metilação do terceiro tercil CpG1, CpG2 e CpG total estavam associados a Hormona Folículo-Estimulante (FSH) e Estradiol (E2) mais baixos. Estes achados sugerem que as proteínas kiss, que é um péptido neuroativo derivado de precursor (pró-hormona, pré-pró-kisspeptina) libertado por neurónios no hipotálamo, poderá ser um biomarcador promissor do efeito de misturas de químicos ambientais no perfil hormonal reprodutivo. No entanto, apesar desta evidência, até ao conhecimento dos investigadores, nenhum estudo de intervenção em humanos destinado a reduzir a exposição a EDCs analisou o impacto molecular que pode acompanhar estas alterações na exposição a EDCs. É necessária mais investigação para esclarecer melhor estas questões, incluindo análises moleculares e ómicas em humanos para elucidar se os estudos de intervenção em humanos destinados a reduzir a exposição a EDCs são capazes de modular favoravelmente estas alterações moleculares.

   Neste projeto, diferentes abordagens moleculares e ómicas serão realizadas para esclarecer melhor, no âmbito do eixo HPA, os condutores epigenéticos mais suscetíveis à alteração e a interação entre a microbiota intestinal e o impacto da exposição a EDCs na inflamação sistémica. Estas análises serão realizadas em amostras obtidas no estudo, tendo em conta os resultados obtidos em modelos pré-clínicos expostos a misturas de EDCs que tentam mimetizar a exposição humana real, para aumentar as chances de obter resultados robustos e fiáveis utilizando uma abordagem direcionada. Especificamente, em crianças pré-púberes, além da microbiota intestinal, os investigadores também avaliarão hormonas relacionadas com o eixo HPA, metilação de diferentes locais CpG de genes-chave envolvidos no eixo HPA e níveis circulantes de kisspeptina utilizando gotas de sangue seco. No geral, estas análises permitir-nos-ão aprofundar os mecanismos pelos quais os EDCs exercem os seus efeitos nocivos, bem como como os estudos de intervenção destinados a reduzir a exposição a estes químicos podem modular estas vias biológicas e os biomarcadores moleculares de exposição identificados. Até ao conhecimento dos investigadores, esta abordagem ainda não foi realizada em grandes estudos de intervenção em humanos no contexto de EDCs.

   1.4. PROJETO HYPIEND A intervenção aqui apresentada faz parte do Projeto Europeu HYPIEND. Este projeto é coordenado pelo Centro Tecnológico da Catalunha (Eurecat), financiado pelo programa-quadro Horizonte Europa (ID do Acordo de Subvenção: 101137440).

   O projeto HYPIEND investiga os efeitos da exposição a múltiplos EDCs na função e programação epigenética do eixo HPA para delinear estratégias de intervenção para minimizar a exposição e as consequências no sistema neuroendócrino durante os estágios perinatal e pré-pubertário.

   O consórcio multidisciplinar HYPIEND é constituído por 14 parceiros de oito países europeus. Entre eles: Stichting Radboud Universiteit (Países Baixos), Institut de Investigació en Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol (Espanha), Sciensano (Bélgica), Kungliga Tekniska Högskolan (Suécia), Katholieke Universiteit Leuven (Bélgica), University of Granada (Espanha), Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego (Polónia), Protoqsar 2000 sl (Espanha), Enco srl (Itália), Fundación para la investigación del hospital universitario la Fe de la Comunidad Valenciana (Espanha), Université de Liège (Bélgica), Université de Genève (Suíça), King's College London (Reino Unido).

   Mais informações sobre este projeto podem ser encontradas nos seguintes links: https://hypiend.eu/ Aqui está uma visão geral da metodologia Hypiend. Dados de bases de dados públicas serão combinados para desenvolver uma base de conhecimento ligando a exposição selecionada a EDCs a resultados de saúde relacionados com o eixo HPA. Metodologias de relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR) serão combinadas com análise de dados para identificar padrões de co-exposição. Misturas de EDCs com alta prevalência nas populações-alvo serão definidas, tanto qualitativa como quantitativamente, de acordo com os padrões de co-exposição. Misturas de EDCs candidatas serão testadas em modelos baseados em células para definir padrões dose-resposta e dosagem para estudos subsequentes. Modelos de peixe-zebra recapitulando eixos HP serão utilizados para selecionar aquelas misturas de EDCs com maior impacto. Em seguida, misturas de EDCs selecionadas serão testadas em modelos de placenta e BHE para avaliar a difusão das misturas de EDCs e caracterizar as frações que atingem tanto o feto como o hipotálamo. Os efeitos no desenvolvimento e função do hipotálamo e hipófise serão avaliados em organoides e OoC derivados de células estaminais, com particular atenção aos efeitos na metilação do ADN de todo o genoma e funcionalidade hormonal. Os resultados serão utilizados para selecionar ainda mais misturas complexas de EDCs de acordo com a sua programação epigenética HP e potencial disruptivo. Posteriormente, animais de laboratório serão expostos a misturas de EDCs desde a gestação até à primeira geração para avaliar a programação e efeitos cumulativos da exposição a EDCs no eixo HPA. Resultados fisiológicos e comportamentais da disrupção HP serão monitorizados. Em paralelo, serão determinados os efeitos na metilação do ADN de células do hipotálamo, hipófise e sangue periférico, bem como alterações em ECV circulantes específicos. Uma abordagem de biologia de sistemas baseada em IA será utilizada para descrever associações entre função hipotálamo/hipófise, padrões de metilação de células sanguíneas hematoperiféricas e dados multiómicos. Estas associações serão utilizadas para estabelecer assinaturas específicas associadas à disrupção HP por exposição a EDCs. Assinaturas serão exploradas em amostras da população-alvo (ou seja, crianças nos seus primeiros 1000 dias e pré-púberes) para explorar a sua traduzibilidade e aplicação como biomarcadores. Estudos em humanos não se limitarão a determinações transversais, mas destinam-se a intervenções inovadoras para promover a diminuição da exposição a EDCs e avaliar a relação causa-efeito. Isto permitirá a definição de biomarcadores com base em dados obtidos dos diferentes pacotes de trabalho e uma abordagem de biologia de sistemas para desvendar mecanismos de ação conservados.

   O trabalho foi proposto como uma sequência de tarefas destinadas a definir o impacto da co-exposição realista a EDCs no eixo HPA de dois estágios de vida-alvo, ou seja, pré-pubertário e perinatal. Os diferentes níveis propostos por organizações como a OCDE, incluindo NAMs e toxicologia computacional, foram adotados para minimizar a investigação animal. Este desenho combina investigação translacional com estudos de intervenção.

2. HIPÓTESE OU QUESTÃO DE ESTUDO Uma MBI em escolas primárias em dois países europeus (Espanha e Bélgica) ao longo de 28 meses reduzirá os níveis urinários de EDCs em crianças pré-púberes e aumentará o conhecimento sobre estes contaminantes.
3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO PRINCIPAL O objetivo geral do HYPIEND é compreender os efeitos da co-exposição a EDCs na função e programação epigenética do eixo HPA, de modo a delinear estratégias de intervenção para minimizar a exposição e as consequências neuroendócrinas durante os estágios perinatal e pré-pubertário.

Neste quadro, o objetivo principal do estudo clínico é demonstrar que uma MBI implementada em escolas primárias em dois países europeus diferentes durante 25 meses é eficaz na redução dos níveis urinários de EDCs de crianças pré-púberes utilizando os construtos HAPA para melhorar a intervenção e o conhecimento sobre estes contaminantes dos seus pais, bem como para aprofundar o conhecimento científico.

3.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS

1. Determinar se uma intervenção concebida para reduzir a exposição a EDCs pode prevenir alguns dos efeitos deletérios relacionados com HP alterado em crianças pré-púberes com idades entre 6 e 8 anos (início mais precoce da fase pubertária e alterações no IMC e função cognitiva).
2. Compreender melhor a relação entre os níveis urinários de EDCs e os níveis hormonais relacionados com HP, bem como padrões de metilação do ADN e composição da microbiota intestinal, esclarecendo melhor os mecanismos pelos quais os EDCs podem exercer os seus efeitos deletérios.
3. Explorar, por análise multivariada e análise de avaliação de risco, preditores de níveis urinários elevados de EDCs.
4. Determinar se uma intervenção baseada nos modelos combinados HAPA1 e PBS2 em escolas primárias é eficaz na melhoria dos construtos HAPA, conhecimento e comportamento de pais, crianças e equipas educativas em relação a estes poluentes, contra uma intervenção placebo.