微生物叢の未熟性を修復し、官能受容性を確立する能力のために、リード微生物叢指向の補完食品（MDCF）プロトタイプを最適化するための「概念の事前証明（Pre-POC）」臨床試験 (MDCF)

治験責任医師は、MAM (WLZ <-2 ～ -3) および発育阻害 (LAZ <-2 ～ -3) の生後 12 ～ 18 か月の子供を対象に、約 2 年間にわたって 3 つの Pre-POC 研究を実施します。

研究デザイン：ランダム化比較介入試験。

調査場所: この調査は、都市周辺のスラム街であるダッカ市ミルプールのバウニアバッドで実施されます。

研究参加者：研究参加者は、MAM（WLZ：<-2〜-3）および発育阻害（LAZ：<-2〜-3）のいずれかの性別の生後12〜18か月の子供になります。

初期スクリーニングと登録: 子供は、事前に指定された包含基準に従って、フィールド リサーチ アシスタント (FRA) による Mirpur のセクション 11 での世帯調査によってスクリーニングされ、登録されます。 登録基準を満たし、親または法定後見人から研究参加の同意を受け取った時点で、それぞれの母親/保護者と一緒にいる子供が登録され、コンピューターで生成された乱数に従って、ランダムに 4 つの腕の 1 つに割り当てられます。研究 1 のための 4 と 12 のさまざまな長さ。 同様に、子供と母親/介護者が登録され、研究 2 と 3 でそれぞれ 3 と 9 のブロック長の並べ替えられたブロックを使用してコンピューターで生成された乱数に従って、3 つのアームのいずれかにランダムに割り当てられます。 割り当てられたタイプの MDCF のコードは、登録された子供に割り当てられるまで、閉じた不透明な封筒に保管されます。

給食セッション: 子供と母親/介護者は、できれば1日目の午前9時から11時と午後3時から5時の間にミルプールのコミュニティに設置された栄養センターに来るように求められます. 母親は、摂食が観察された日の観察された食事時間の前の 2 時間に、食物と母乳を与えない/許可しないように要求されます。 同じ日に、栄養センターで、無作為に割り当てられたように、子供には25グラムのMDCFが提供されます（できれば午前9時から11時までと午後3時から5時までの2回の食事で）。 授乳中、母親は、以下に説明するように、子供がそれ以上食べることを拒否するまで、それぞれの事前に計量された食事を子供にスプーンで与えるように求められます. 2 分間休止した後、再度拒否するまで、同じ食事をもう一度提供します。 2 回目の 2 分間の休止の後、再度拒否されるまで、3 回目の食事が提供されます。 この 3 回目の拒否の後、給餌エピソードは「終了」したものと見なされます。 摂食時間（間にある「休憩時間」を除く）をストップウォッチで記録し、摂食時間の合計を記録します。 すべての食事を食べ終わった後、子供がさらに要求した場合、最初に提供された量が提供されます。 この給餌エピソードは最大 60 分間続きます。 測定された普通の水の量も与えられ、この 60 分間の食事時間中に摂取された水の量が測定されます。 給餌エピソードは、訓練を受けた研究担当者の直接監督の下で行われます。 子供は、食べ物から頭を離したり、泣いたり、口を挟んだり、歯を食いしばったり、動揺したり、食べ物を吐き出したり、飲み込むことを拒否したりすると、それ以上の摂取を拒否したと見なされます.8 実際に摂取されたMDCFの量は、提供された量から残りを差し引いて計算されます. 事前に計量されたナプキンが提供されます。逆流、嘔吐、またはこぼれた食べ物は綿棒で拭き取り、重量を量り、提供された量から差し引かれます。

彼らがすぐに食べ物を食べ、観察された食事中に大騒ぎせず、吐き出したり、吐いたり、泣いたりしなかった場合、受容性は「熱心に受容された」と分類されます。 子供たちは、提供された食べ物を食べたが、観察された食事中に大騒ぎしたり、吐き出したり、嘔吐したり、泣いたりした場合、「受け入れたが熱心ではない」と分類されます。 3 番目のカテゴリーは、提供された食品をまったく食べない子供です。

摂取した食物の量（g）、エネルギー（kcal）、受容性のカテゴリーが分析されます。 登録された子供たちは、訓練を受けたフィールドフィールドリサーチアシスタントによる毎日の家庭訪問によって、起こりうる副作用/有害事象（例： 発疹、食物アレルギーによる蕁麻疹または臨床状態の重大な変化）を1週間。 副作用/有害事象が観察された場合は、icddr のダッカ病院で提供される標準的な管理に従って治療されます。 それぞれの母親/介護者による割り当てられた MDCF の官能特性の知覚と評価も、7 点のヘドニック スケールを使用して評価されます。 高い値の 7 は「非常に好き」とランク付けされ、最も低い値 1 は「非常に嫌い」とランク付けされます。

研究の開始時に、人口統計学的特徴（家族の富、住居の基準、家族構成、親の特徴など）に関する情報が求められ、訓練を受けた FRA が 2 グラムの精度のデジタル スケールを使用して子供の裸の体重を記録します。 (Seca、モデル 728、ドイツ)、長さ (インファントメーター、Seca、モデル 416、ドイツを使用)、および上腕の円周 (非ストレッチ挿入テープを使用) を最も近い mm まで。 人体測定は標準的な手順に従って行われ、すべての測定値は 3 回取得され、中間の測定値が記録されます。 各研究におけるすべての介入は、Mirpur ヘルス クリニックで子供たちに施されます。 母親/主介護者は、子供の現在の食事と母乳育児の慣行を維持するようにアドバイスされます.

Pre-POC 研究 1 および 2 は、それぞれ 8 週間の期間で、それぞれ 4 群および 3 群で構成され、1 群あたり 12 ～ 15 人の子供が登録され、1 群あたり最低 10 人の子供が研究を完了します。 治療前の MAZ を定義するための 2 週間の慣らし期間があり、さらに、MAZ スコアの計算に使用されるのと同じ糞便検体中の広範囲の胃腸病原体の PCR に基づく測定によって、腸内病原体負荷が評価されます (これらは、その後の治療のためのスクリーニングツールとして使用しないでください)。 子供たちは 3 つのアームのいずれかにランダムに割り当てられます。 性別に関して腕のバランスを取り、年齢で無作為化を階層化するための努力がなされます (例: 2 レベル; 12 ～ 15 か月および >15 ～ 18 か月)。 治療段階は4週間で、その間、各試験製品はテストセンターで1日2回、少なくとも6時間間隔で投与されます。 2週間の介入後フェーズがあり、2つの追加の糞便サンプルが収集され（7および8週の終わりに）、治療の中止後に発生する微生物叢の変化を評価します。

Pre-POC Study 3 には 3 つのアームがあります。 研究 2 で特定された主要な MDCF をテストし、4 週間の介入期間にわたって現在の RUSF 標準治療と比較して、微生物叢の未熟さを修復するその有効性をベンチマークします。 この研究では、リードMDCFの1日1回投与と2回投与の有効性に対する影響を調べ、介入後4週間の期間（7、8、9、10週の終わりに糞便サンプリングを行う）も含めます。介入を中止し、家庭の食事に戻った後の微生物叢の成熟度の変化の持続性を評価します。

糞便サンプルの収集 週ごとの糞便サンプル (1 ～ 2g) は、生産から 30 分以内に収集されます (自宅で、icddr に戻されます)。治療のために地元の RUTF の最近の研究で使用された N2 乾燥荷送人標本収集 SOP を使用します。 SAMの（付録Aを参照）。 標本は-80℃で保存され、各研究の終わりにゴードン研究所に送られ、微生物叢の成熟度（各MDCFプロトタイプによる治療中止前、中止中、中止後に測定）とPCRに基づく腸内病原体の評価が迅速に行われます。糞便サンプルの負荷 (MDCF 処理の前後に測定)。 次世代 MDCF によって具体的に標的にされた各菌株の相対的存在量は、16S rRNA データセットの分析を通じて決定されます (Gordon Lab で実施され、主要な BMMI プロジェクト POC フェーズ助成金によって資金提供されています)。

提案された Pre-POC 研究

研究 1: 3 つのプロトタイプ MDCF と MAM の現在の米レンズ豆 RUSF ケア標準をテストして、MAZ 修復に対するそれぞれの効果の大きさを確立します。微生物叢における MDCF 誘発性の変化:

アーム 1 - 現在の RUSF を MAM に使用、1 日 2 回で 4 週間投与 アーム 2 - プロトタイプ MDCF1、1 日 2 回で 4 週間投与 アーム 3 - プロトタイプ MDCF2、1 日 2 回で 4 週間投与 アーム 4 - プロトタイプ MDCF3、2 回投与/日 4 週間

アーム 1 - 米レンズ豆ベースの RUSF (論理的根拠: MAM の参照基準のケア; 腸内微生物叢または微生物叢の未熟性への影響に関する知識に基づいて設計されたものではありません)。

アーム 2 - 4 つの補完的な食品成分と粉ミルクを含む MDCF プロトタイプ (理論的根拠: 微生物叢の未熟さの修復と成長へのプラスの影響の前臨床ノトバイオティック モデルからの証拠によるリード)。

アーム 3 - 粉ミルクを含まない 4 つの補完食品成分を含む MDCF プロトタイプ (論理的根拠: 牛乳の中止が、微生物叢と宿主バイオマーカーに対する 4 つの補完食品成分の組み合わせの効果に影響を与えるかどうかを判断します)。

アーム 4 - 粉ミルクを含まない 2 つの補助食品成分 (ひよこ豆と大豆粉) を含む MDCF プロトタイプ (理論的根拠: この製剤の有効性を、グループ 3 に投与された 4 つの補助食品成分を含む MDCF 製剤の有効性と比較する)。

糞便サンプルの収集:

糞便サンプルは、登録時、登録後1週間、無作為化時（2週間）、および介入および介入後の段階で毎週、各子供から収集されます。

-研究参加者を 15 名/アームと 4 アームと仮定すると、合計 540 の糞便検体がスタディ 1 で収集されます。

採血：

介入前と介入完了直後に、すべての子供からそれぞれ 2 mL の血液サンプルを採取します。

-15人の研究参加者/腕を想定すると、合計120の血液サンプルがStudy1で収集されます。

研究 2: 研究 1 から最も効果的な MDCF を選択し、研究 1 で使用したのと同じデザインを使用した 2 つの追加の MDCF プロトタイプと比較します。

アーム 1 - 研究 2 の「勝者」は、1 日 2 回、4 週間投与された アーム 2 - プロトタイプ MDCF4 は、1 日 2 回、4 週間投与された アーム 3 - プロトタイプ MDCF5 は、4 週間、1 日 2 回投与された

糞便サンプルの収集:

糞便サンプルは、登録時、登録後1週間、無作為化時（2週間）、および介入および介入後の段階で毎週、各子供から収集されます。

・試験参加者を15名/アームと3アームと仮定すると、試験2で合計405個の糞便検体が採取されます。

採血：

介入前と介入完了直後に、すべての子供からそれぞれ 2 mL の血液サンプルを採取します。

- 15 人の研究参加者/アーム、合計 90 の血液サンプルが研究 2 で収集されます。

スタディ 3:

研究 1、2 からリード MDCF を選択し、現在の RUSF に対して最終的な「ベイクオフ」を実施し、介入後 4 週間の期間で 1 日あたり 1 回と 2 回の投与の影響を調べて、MDCF 主催の耐久性に関する追加情報を提供します。微生物叢の変化:

アーム 1 - MAM に使用される現在の RUSF を 1 日 2 回、4 週間、その後 4 週間の介入後フェーズ アーム 2 - 研究 2 で特定されたリード MDCF、4 週間、1 日 2 回、その後 4 週間の介入後フェーズ アーム 3 -研究2で特定されたリードMDCF、4週間1日1回、その後4週間の介入後フェーズ

糞便サンプルの収集:

治療前の2週間、治療中の4週間、および治療中止後の2週間を含む8週間の研究の過程で、各研究参加者から毎週糞を収集します（11サンプル/子供）。

・試験参加者を15名/アームと3アームと仮定すると、試験3で合計495個の糞便検体が採取されます。

8 週間の研究期間 (研究 1 および 2) と、糞便標本のワシントン大学への発送、DNA の抽出、細菌 16S rRNA 遺伝子の V4 領域の PCR 増幅、これらのアンプリコンの配列決定、およびデータ分析に 8 週間を想定すると、登録の完了からデータ分析の完了までの各研究サイクルは 16 週間と予想されます。 このサイクル時間により、2017 年 6 月末までに候補 MDCF を評価し、2018 年 4 月末までに 5 つすべてを完了することができると予想しています。この時点で、主要な MDCF が POC 研究に指名されます。

収集された情報は、無菌動物に移植するためのヒトの糞便サンプルを選択するために使用されます。人間の微生物叢のドナーの食事を与えられるこれらの動物は、MDCF プロトタイプ、腸内微生物叢、および宿主の生理学/代謝を結びつけるメカニズムをさらに特徴付けるために使用されます。

胆汁酸や短鎖脂肪酸 (SCFA) などの血漿および/または糞便サンプル中の特定の分析対象物をプロファイリングするために、ターゲット超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析 (UPLC-MS) およびガスクロマトグラフィー - 質量分析 (GC-MS) が使用されます。 );ミトコンドリア機能のマーカー（例：β-ヒドロキシブチレート、アシルカルニチン/アシルCoAs、TCAサイクル中間体）;糞便サンプル中のアミノ酸 [分枝鎖アミノ酸、細菌のトリプトファン代謝によって生成されるものを含む、増殖および炎症状態に関連するトリプトファンおよびトリプトファン代謝物 (例: インドール酢酸誘導体）］。

採血：

介入前と介入完了直後に、すべての子供からそれぞれ2mLの血液サンプルが採取されます.15 研究参加者/腕と3つの腕、合計90の血液サンプルが研究3で収集されます。

同じコミュニティの健康に成長している子供たちの腸内微生物叢のライブラリーを構築するために、12 歳から 18 歳の子供たち 30 人から 1 つのスポット糞便サンプル (1-2 gm) とスポット血液サンプル (2 mL) を収集します。 WLZ と LAZ のいずれかの月: >-1. これは、研究参加者から同意を得た後にのみ行われます。

私たちの最初の研究室での作業と、ワシントン大学ゲノム科学センターで行われたノトバイオート動物に関する以前の研究を通じて、粉乳の有無にかかわらず、食品成分（ひよこ豆、大豆粉、ピーナッツ、緑のバナナ）の組み合わせがコストと持続可能性だけでなく、成長を差別する微生物叢の増殖を刺激する食事の影響に関しても、研究する価値があります。

研究参加者は、食物の共有の問題を避けるために、栄養療法のために毎日指定された給餌センターに来るように求められます. 彼らには診療所のスタッフに連絡するための電話番号が提供され、スタッフのメンバーは、必要に応じて事前に手配して、栄養療法を直接観察するために家族の家庭を訪問することができます.

登録時、無作為化の前、および研究期間全体を通して毎週、5日間の食物頻度アンケートに記入します。

異なる MDCF の準備:

Pre-POC 臨床試験のための補完食の準備:

上記の前臨床研究で特定された補完的な食品成分の互換性のある組み合わせに基づいて、研究者は臨床研究に十分な量の icddr,b 食品加工研究所で 5 つの MDCF プロトタイプを設計および製造します (研究 1 では 3 つの MDCF プロトタイプ、研究では 2 つの MDCF プロトタイプスタディ 2 およびスタディ 3 のスタディ 2 からの認定 MDCF)。 これらの処方は、エネルギー密度と微量栄養素の含有量が、バングラデシュやその他の国で MAM に使用されるすぐに使える補助食品 (RUSF) と一致し、生後 12 ～ 18 か月の補完/補助食品に関するその他すべての現地要件を満たします。 MAMと発育阻害の子供たち。 icddr,b Food Processing Laboratory は、研究 1 および 3 で使用するために、これらの子供たちの治療に使用される現在の米とレンズマメの RUSF 標準治療も作成します。

製品の開発

1. 食品成分の識別: 前臨床の食事変動研究で識別されたものを含む、現地で入手可能な食品成分 (例: ひよこ豆、大豆粉、ピーナッツ、生のバナナ、大豆油、砂糖、粉乳の有無にかかわらず) を使用してプロトタイプ MDCF を製造します。

   MDCFは、バングラデシュの補助食品の微量栄養素要件を満たすために、ビタミンとミネラルのプレミックスで強化されます（以下を参照）.

2. レシピ開発に関する実験: 最も栄養価の高いレシピをもたらす成分の組み合わせを特定するために、線形計画法に基づいて MDCF 成分の理論的な配合を行うものとします。 MDCF のエネルギー密度は 5 kcal/g を目標とし、カロリー分布は脂肪から 45 ～ 50 パーセント、タンパク質から 8 ～ 12 パーセントを目標としています。 研究チーム内の専門家の意見とコンセンサスに基づいて、微量栄養素の含有量は、生後 12 ～ 18 か月の非 SAM 子供の必要量の 70% をカバーするように設定されます。 レシピの開発とサンプルの準備のための実験は、各生産バッチからの MDCF の品質を管理し、加工中に予期しない汚染や栄養素の損失が発生しないようにするための標準化された生産手順に従って、icddr,b 食品加工研究所で行われます。 すべての成分は洗浄され、分類されます。 潜在的なレシピは、(各材料に応じて調理/蒸し/焙煎) した後、電動ブレンダーですべての材料を混合することにより、小さなバッチで作成する必要があります。 必要に応じて、乾燥材料と大豆油の量を変えることで、レシピの一貫性を調整する必要があります。 さらに、多量の微量栄養素の添加に不快な味がする場合は、ミネラルとビタミンの組み合わせを調整する必要があります。 少量（1％）の大豆レシチンをレシピに加えて、一貫性を改善し、油の分離を防ぎます.
3. レシピの官能特性の評価: 新しいレシピは、7 点のヘドニック スケールを使用して、外観、風味、食事の一貫性、および全体的な好みの度合いについて評価されます。 それより高い値、つまり 7 は「非常に好き」とランク付けされ、最も低い値 1 は「最も嫌い」とランク付けされます。
4. 食品の安全性と賞味期限の問題の研究: 研究者は、微生物学的品質を含む製品の安定性を評価して、最初の「賞味期限」の日付を設定するために必要な重要な情報を取得し、ビタミンとミネラルの含有量の安定性と酸化の可能性を評価します。 標準的な微生物検査（総生菌数、酵母菌、カビ、大腸菌群、大腸菌、セレウス菌、ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス、クロノバクター・サカザキ）は、icddr,b 食品安全研究所で実施されます。
5. プレ POC 臨床試験用の 5 つのプロトタイプ MDCF の完成: 上記のすべての基準に基づいて、当社の研究者チームは受容性試験用に 5 つの MDCF を選択します。 研究者は、候補 MDCF の成分の 1 kg あたりのコストも推定します。

フィールド スタッフのトレーニング 糞便サンプルの収集に関するさまざまな手順について、すべてのフィールド チーム メンバーにトレーニングが提供されます。 トレーニングは、研究の研究者だけでなく、トレーナーのコアグループによって促進されます。

人体測定:

お子様の年齢は、書類 (出生証明書または予防接種カードがあれば) または保護者によるお子様の生年月日の報告書と照らし合わせて確認されます。 長さは、0.1 cm 感度のインファントメーター (SECA、モデル番号 . 4161721009、ハンブルク、ドイツ)。 体重は、2 gに敏感な天秤（SECA 7281321009、ハンブルグ、ドイツ）によって測定されます。 年齢に対する長さ (LAZ)、長さに対する体重 (WLZ)、および年齢に対する体重 (WAZ) の Z スコアは、Multicenter Growth Reference Study (MGRS) WHO の成長基準に従って計算されます 11。 浮腫は、両足の甲側を 3 秒間押して検査します。 TALC MUACテープ（英国）を使用して上腕周囲（MUAC）を測定します。 測定機器の標準化：赤ちゃんの体重計、および既知の重量と長さを持つ長さ/長さボードの定期的な標準化が行われます。

血漿および糞便サンプルの分析

この探索的プレ POC 研究で収集された血漿サンプルは、セントルイスのワシントン大学のゲノム科学およびシステム生物学センターにある Jeffrey Gordon の研究室に送られます。 高度な質量分析およびイムノアッセイベースの方法を使用して、腸内微生物叢の未成熟の役割と、この未成熟の急性修復を試みることのバイオマーカーおよび健康のメディエーターに対するリード微生物叢指向の補完食品（MDCF）プロトタイプによる影響についての新しい知識を得るために使用されます。成長。

微生物叢の未熟性と食事介入に対する宿主の反応に対するMDCFの影響に関するこの最初のテストは、より大きな集団で計画された概念実証研究の検出力計算を可能にする重要なデータセットを提供します。 現在の探索的プレ POC では、12 ～ 15 人の研究参加者の各グループの各子供が自分のコントロールとして機能します。 追加の比較は、4 つの治療グループ内および全体で行われます (つまり、参照 RUSF 標準、および 3 つの異なる MDCF 製剤の 1 つを消費するグループ)。

糞便は、治療前の 2 週間、治療中の 4 週間、および治療中止後の 2 週間を含む 8 週間の研究の過程で、各研究参加者から毎週収集されます。 さらに、4 週間の MDCF 介入を開始する直前、および 4 週間にわたる介入が完了した時点で、2 mL の血液サンプルが採取されます。

胆汁酸や短鎖脂肪酸 (SCFA) などの血漿および/または糞便サンプル中の特定の分析対象物をプロファイリングするために、ターゲット超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析 (UPLC-MS) およびガスクロマトグラフィー - 質量分析 (GC-MS) が使用されます。 );ミトコンドリア機能のマーカー（例：β-ヒドロキシブチレート、アシルカルニチン/アシルCoAs、TCAサイクル中間体）;血清および糞便サンプル中のアミノ酸 [分岐鎖アミノ酸、細菌のトリプトファン代謝によって生成されるものを含む、成長および炎症状態に関連するトリプトファンおよびトリプトファン代謝物 (例: インドール酢酸誘導体）］。

さらに、線形成長 (成長ホルモンや IGF-1 など)、エネルギー利用 (インスリン、レプチン)、および骨生物学 [IL-6、オステオプロテゲリン、I 型コラーゲンの C 末端ペプチド (CTX 、破骨細胞活性/骨吸収のマーカー)、および1型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P1NP、骨芽細胞活性/骨形成のマーカー)]、および全身性炎症(CRP、AGP)は、確立されたELISAを使用して定量化されます/ルミネックスアッセイ。

収集された情報は、無菌動物に移植するためのヒトの糞便サンプルを選択するために使用されます。人間の微生物叢のドナーの食事を与えられるこれらの動物は、MDCF プロトタイプ、腸内微生物叢、および宿主の生理学/代謝を結びつけるメカニズムをさらに特徴付けるために使用されます。 さらに、これらの血漿および糞便バイオマーカーを使用して、前臨床モデルの機能が子供の反応と最もよく相関していることを判断します。この知識は、成長の成果に優れた効果を持つ次世代 MDCF プロトタイプの設計に役立つでしょう。

サンプルサイズの計算:

この研究の主な結果は、4 週間の介入後の年齢 Z に対する微生物叢 (ΔMAZ) スコアの変化です。 0.36 (SEM) 同年齢の健康な子供の場合、MAZ の平均値は -0.52+0.22 でした。 1.08+0.41 の平均値の差があります。 対応のある t 検定に R の power.t.test 関数を使用する (つまり、 介入前後の子供からのサンプルのペアリング)、SD を 1 と仮定し、片側仮説を使用すると、各腕に 15 人の子供がいると、80% の検出力と有意閾値0.05。 したがって、研究者は、以前の研究で、健康な子供の微生物叢とMAMの子供の微生物叢を区別した大きさのMAZの変化を自信を持って検出するのに十分な力があると予想しています。

データ解析 ：

データ分析は、微生物叢の成熟度を計算するために使用されたのと同じアプローチで行われ、icddr,b5 で SAM を持つ子供を治療する以前の RUTF 介入研究でこれらのツールが適用されます。

各研究の主要な結果の尺度は、研究の各アームのベースラインからのMAZスコアの平均治療誘発変化です。 治療群の平均値間の差異 (95% CI) は、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Tukey の HSD または同様の事後検定 (適切な場合) を使用して評価されます。 これらの pre-POC 研究で最大の平均効果サイズと許容可能な官能特性を持つ MDCF プロトタイプは、ポスト SAM MAM の子供の臨床転帰を調べるための後続の POC 臨床試験用に選択されます。