Sperimentazioni cliniche "Pre-Proof of Concept (Pre-POC)" per ottimizzare i prototipi di alimenti complementari diretti dal microbiota di piombo (MDCF) per la loro capacità di riparare l'immaturità del microbiota e stabilire la loro accettabilità organolettica (MDCF)

Gli investigatori condurranno 3 studi pre-POC su bambini di 12-18 mesi con MAM (WLZ <-2 a -3) e arresto della crescita (LAZ <-2 a -3) nel corso di circa due anni.

Disegno dello studio: studio di intervento controllato randomizzato.

Sito dello studio: questo studio sarà condotto a Bauniabadh, Mirpur nella città di Dhaka, che è una zona periurbana dei bassifondi.

Partecipanti allo studio: i partecipanti allo studio saranno bambini di 12-18 mesi di entrambi i sessi con MAM (WLZ: <-2 a -3) e arresto della crescita (LAZ: <-2 a -3).

Screening iniziale e iscrizione: i bambini saranno sottoposti a screening e arruolati mediante un'indagine sulle famiglie nella sezione 11 di Mirpur da Field Research Assistants (FRA) seguendo criteri di inclusione prestabiliti. Soddisfacendo i criteri di iscrizione e dopo aver ricevuto il consenso alla partecipazione allo studio da parte dei genitori o dei tutori legali, i bambini con la rispettiva madre/tutore saranno iscritti e assegnati in modo casuale a uno dei quattro bracci in base a numeri casuali generati dal computer utilizzando blocchi permutati di lunghezze variabili di quattro e dodici per lo studio 1. Allo stesso modo, i bambini e la madre/caregiver saranno arruolati e assegnati in modo casuale a uno dei tre bracci in base a numeri casuali generati dal computer utilizzando blocchi permutati di lunghezze di blocco di tre e nove rispettivamente per lo studio 2 e 3. Il codice del tipo di MDCF assegnato sarà conservato in buste opache chiuse fino all'assegnazione ad un bambino iscritto.

Sessioni di alimentazione: i bambini e le madri/tutori saranno invitati a venire al centro nutrizionale istituito nella comunità di Mirpur preferibilmente tra le 9:00 e le 11:00 e tra le 15:00 e le 17:00 del giorno 1. Alle madri verrà richiesto di non dare/consentire cibo e latte materno nelle 2 ore precedenti l'orario del pasto osservato nel giorno dell'alimentazione osservata. Lo stesso giorno al centro nutrizionale, al bambino verranno offerti 25 grammi (in due pasti preferibilmente tra le 9-11 e le 15-17) di MDCF secondo un'assegnazione casuale. Durante il periodo di allattamento, alle madri verrà chiesto di somministrare ai propri figli le rispettive diete pre-pesate fino a quando non si rifiuterà di mangiare ulteriormente, come descritto di seguito. Dopo una pausa di due minuti, la stessa dieta verrà proposta una seconda volta fino a quando non si rifiuterà nuovamente. Dopo una seconda pausa di due minuti, la dieta verrà proposta una terza volta fino a quando non verrà nuovamente rifiutata. Dopo questo terzo rifiuto, l'episodio alimentare sarà considerato come 'terminato'.7 La durata dell'alimentazione (esclusi i 'periodi di riposo' intermedi) verrà registrata dal cronometro e verrà annotata la durata totale dell'alimentazione. Se il bambino chiede di più dopo aver finito tutto il cibo, gli verrà offerta la quantità che gli era stata offerta all'inizio. Questo episodio di alimentazione durerà per un massimo di 60 minuti. Verranno forniti anche i volumi misurati di acqua naturale e verrà misurata la quantità di acqua assunta durante questo periodo di pasto di 60 minuti. L'episodio di alimentazione avverrà sotto la diretta supervisione di personale dello studio addestrato. Si considererà che i bambini rifiutano un'ulteriore assunzione se allontanano la testa dal cibo, piangono, chiudono la bocca o stringono i denti, o si agitano, sputano il cibo o si rifiutano di deglutire.8 La quantità di MDCF effettivamente ingerita verrà calcolata sottraendo l'avanzo dalla quantità offerta. Verranno forniti tovaglioli prepesati; qualsiasi alimento rigurgitato, vomitato o versato verrà tamponato, pesato e sottratto dalla quantità offerta.

L'accettabilità sarà classificata come "accettata con entusiasmo" se hanno mangiato cibo prontamente, non hanno fatto storie, non hanno sputato, vomitato o pianto durante il pasto osservato. I bambini saranno classificati come "accettati ma non con entusiasmo" se hanno mangiato il cibo offerto ma hanno fatto storie, sputato, vomitato o pianto durante il pasto osservato. La terza categoria saranno i bambini che non consumeranno affatto il cibo offerto.9

Verranno analizzate la quantità di cibo consumato (g), l'energia (kcal) e la categoria di accettabilità. I bambini arruolati saranno monitorati da visite domiciliari giornaliere da assistenti di ricerca sul campo addestrati per eventuali possibili effetti collaterali/eventi avversi (ad es. eruzione cutanea, orticaria dovuta ad allergia alimentare o qualsiasi cambiamento significativo dello stato clinico) per una settimana. Se si osservano effetti collaterali/eventi avversi, verranno trattati secondo la gestione standard fornita presso l'ospedale di Dhaka dell'icddr,b. La percezione e la valutazione delle caratteristiche organolettiche degli MDCF assegnati da parte della rispettiva madre/caregiver sarà valutata anche utilizzando la scala edonica a 7 punti. Il valore più alto, ovvero 7, sarà classificato come "estremamente apprezzato" e il valore più basso 1 verrà classificato come "estremamente antipatico".10

All'inizio dello studio, si cercheranno informazioni sulle caratteristiche demografiche (ricchezza delle famiglie, standard abitativo, struttura familiare e caratteristiche dei genitori, ecc.) e FRA addestrati registreranno il peso nudo dei bambini utilizzando una bilancia digitale con una precisione di 2 g (Seca, modello 728, Germania), lunghezza (utilizzando l'infantometro, Seca, modello 416, Germania) e circonferenza della metà della parte superiore del braccio al mm più vicino (utilizzando un nastro di inserimento non estensibile). L'antropometria verrà eseguita secondo le procedure standard e tutte le misurazioni verranno effettuate tre volte e quella centrale verrà registrata. Tutti gli interventi in ogni studio saranno somministrati ai bambini presso la clinica sanitaria di Mirpur. Alle madri/tutori primari verrà consigliato di mantenere le attuali pratiche dietetiche e di allattamento del loro bambino.

Gli studi pre-POC 1 e 2 avranno ciascuno una durata di 8 settimane e avranno rispettivamente 4 e 3 bracci, con 12-15 bambini arruolati per braccio con un minimo di 10 bambini per braccio che completano lo studio. Ci sarà un periodo di prova di 2 settimane per definire la MAZ pre-trattamento e, inoltre, il carico di enteropatogeni sarà valutato mediante misurazione basata su PCR di un'ampia gamma di patogeni gastrointestinali negli stessi campioni fecali utilizzati per calcolare i punteggi MAZ (questi saranno non essere utilizzati come strumenti di screening per il successivo trattamento). I bambini verranno assegnati in modo casuale a uno dei tre bracci. Verranno compiuti sforzi per bilanciare le braccia rispetto al genere e stratificare la randomizzazione in base all'età (ad es. 2 livelli; 12-15 mesi e > 15-18 mesi). La fase di trattamento durerà 4 settimane, durante le quali ciascun prodotto di prova verrà somministrato presso il centro di test due volte al giorno, separati da almeno 6 ore. Ci sarà una fase post-intervento di 2 settimane in cui verranno raccolti altri 2 campioni di campioni fecali (alla fine delle settimane 7 e 8) per valutare i cambiamenti nel microbiota che si verificano dopo l'interruzione del trattamento.

Pre-POC Studio 3 avrà 3 bracci. Testerà l'MDCF principale identificato nello studio 2 e valuterà la sua efficacia nel riparare l'immaturità del microbiota rispetto all'attuale standard di cura RUSF per un periodo di intervento di 4 settimane. In questo studio esamineremo l'impatto della somministrazione di 1x vs 2x al giorno del piombo MDCF sull'efficacia e includeremo anche un periodo post-intervento di 4 settimane (con campionamento fecale alla fine delle settimane 7, 8, 9 e 10) per valutare la durata dei cambiamenti nella maturità del microbiota dopo la cessazione dell'intervento e il ritorno alla dieta domestica.

Raccolta di campioni fecali Campioni fecali settimanali (1-2 g) saranno raccolti entro 30 minuti dalla produzione (a casa e trasportati all'icddr,b) utilizzando la SOP per la raccolta di campioni di caricatori secchi di N2 utilizzata nel recente studio sui RUTF locali per il trattamento di SAM (vedi Appendice A). I campioni saranno conservati a -80◦C prima di essere inviati al Gordon Lab alla fine di ogni studio per una rapida analisi della maturità del microbiota (misurata prima, durante e dopo la cessazione del trattamento con ciascun prototipo MDCF) e valutazione basata su PCR dell'enteropatogeno carico nei campioni fecali (misurato prima e dopo il trattamento con MDCF). L'abbondanza relativa di ciascuno dei ceppi batterici che sono stati specificamente presi di mira dall'MDCF di prossima generazione sarà determinata attraverso l'analisi dei set di dati 16S rRNA (eseguita nel Gordon Lab e finanziata dalla sovvenzione primaria della fase POC del progetto BMMI)

Studi pre-POC proposti

Studio 1: prova 3 prototipi di MDCF e l'attuale standard di cura RUSF di riso-lenticchia per MAM per stabilire la dimensione dell'effetto di ciascuno sulla riparazione MAZ in un intervento di 4 settimane 2 volte al giorno, con una fase post-intervento di 2 settimane per valutare la durata di Cambiamenti indotti da MDCF nel microbiota:

Braccio 1 - RUSF corrente utilizzato per MAM, somministrato 2 volte al giorno per 4 settimane Braccio 2 - Prototipo MDCF1, somministrato 2 volte al giorno per 4 settimane Braccio 3 - Prototipo MDCF2, somministrato 2 volte al giorno per 4 settimane Braccio 4 - Prototipo MDCF3, somministrato 2 volte /giorno per 4 settimane

Braccio 1 - RUSF a base di lenticchie di riso (motivazione: standard di cura di riferimento per MAM; non progettato sulla base della conoscenza dei suoi effetti sul microbiota intestinale o sull'immaturità del microbiota).

Arm 2 - prototipo MDCF con quattro ingredienti alimentari complementari più latte in polvere (motivazione: piombo con prove da modelli gnotobiotici preclinici di riparazione dell'immaturità del microbiota ed effetti positivi sulla crescita).

Arm 3 - prototipo MDCF con quattro ingredienti alimentari complementari senza latte in polvere (motivazione: determinare se il ritiro del latte influisce sugli effetti delle quattro combinazioni di ingredienti alimentari complementari sul microbiota e sui biomarcatori dell'ospite).

Braccio 4 - prototipo MDCF con due ingredienti alimentari complementari (farina di ceci e di soia) senza latte in polvere (motivazione: confrontare l'efficacia di questa formulazione con quella della formulazione MDCF contenente quattro ingredienti alimentari complementari che viene somministrata al gruppo 3).

Raccolta di campioni fecali:

I campioni fecali saranno raccolti da ciascun bambino all'arruolamento, 1 settimana dopo l'arruolamento, alla randomizzazione (2 settimane) e settimanalmente durante le fasi di intervento e post-intervento.

-Ipotizzando 15 partecipanti allo studio per braccio e 4 bracci, nello Studio 1 verranno raccolti un totale di 540 campioni fecali.

Prelievo di campioni di sangue:

Saranno raccolti 2 ml di campioni di sangue ciascuno da ogni bambino prima dell'intervento e subito dopo il completamento dell'intervento.

-Ipotizzando 15 partecipanti allo studio/braccia, nello Studio1 verranno raccolti un totale di 120 campioni di sangue.

Studio 2: selezionare l'MDCF più efficace dallo studio 1 e confrontarlo con 2 prototipi MDCF aggiuntivi utilizzando lo stesso design utilizzato nello studio 1:

Braccio 1 - "Vincitore" dallo studio 2 somministrato 2 volte al giorno per 4 settimane Braccio 2 - Prototipo MDCF4 somministrato 2 volte al giorno per 4 settimane Braccio 3 - Prototipo MDCF5 somministrato 2 volte al giorno per 4 settimane

Raccolta di campioni fecali:

I campioni fecali saranno raccolti da ciascun bambino all'arruolamento, 1 settimana dopo l'arruolamento, alla randomizzazione (2 settimane) e settimanalmente durante le fasi di intervento e post-intervento.

-Ipotizzando 15 partecipanti allo studio per braccio e 3 bracci, nello Studio 2 verranno raccolti un totale di 405 campioni fecali.

Prelievo di campioni di sangue:

Saranno raccolti 2 ml di campioni di sangue ciascuno da ogni bambino prima dell'intervento e subito dopo il completamento dell'intervento.

- 15 partecipanti allo studio/braccia, nello Studio 2 verranno raccolti un totale di 90 campioni di sangue.

Studio 3:

Seleziona MDCF principale dagli studi 1, 2 e conduci il "bake-off" finale rispetto all'attuale RUSF ed esamina anche l'impatto della somministrazione 1x vs 2x al giorno con un periodo post-intervento di 4 settimane per fornire ulteriori informazioni sulla durata della somministrazione sponsorizzata da MDCF cambiamenti nel microbiota:

Braccio 1 - RUSF corrente utilizzato per MAM 2 volte al giorno per 4 settimane seguito da una fase post-intervento di 4 settimane Braccio 2 - MDCF di piombo identificato nello studio 2, 2 volte al giorno per 4 settimane seguito da una fase post-intervento di 4 settimane Braccio 3 - Piombo MDCF identificato nello studio 2, 1 volta al giorno per 4 settimane seguito da una fase post-intervento di 4 settimane

Raccolta di campioni fecali:

Le feci sarebbero state raccolte settimanalmente da ciascun partecipante allo studio durante il corso dello studio di 8 settimane, comprese le 2 settimane prima del trattamento, le quattro settimane durante il trattamento e le due settimane successive alla cessazione del trattamento (11 campioni/bambino).

-Ipotizzando 15 partecipanti allo studio per braccio e 3 bracci, nello Studio 3 verranno raccolti un totale di 495 campioni fecali.

Supponendo una durata dello studio di 8 settimane (studi 1 e 2) e 8 settimane per la spedizione di campioni fecali alla Washington University, estrazione del DNA, amplificazione PCR della regione V4 dei geni batterici 16S rRNA, sequenziamento di questi ampliconi e analisi dei dati, ogni ciclo di studio dal completamento dell'iscrizione al completamento dell'analisi dei dati dovrebbe essere di 16 settimane. Con questo tempo di ciclo, prevediamo di poter valutare i MDCF candidati entro la fine di giugno 2017 e completarli tutti e 5 entro la fine di aprile 2018, a quel punto verrà nominato un MDCF principale per lo studio POC.

Le informazioni raccolte saranno utilizzate per selezionare campioni fecali umani per il trapianto in animali privi di germi; questi animali, che saranno nutriti con le diete dei loro donatori di microbiota umano, saranno utilizzati per caratterizzare ulteriormente i meccanismi che collegano i prototipi di MDCF, il microbiota intestinale e la fisiologia/metabolismo dell'ospite.

Saranno utilizzate la cromatografia liquida ultra performante-spettrometria di massa (UPLC-MS) e la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) per profilare analiti di interesse specifico in campioni di plasma e/o fecali, inclusi gli acidi biliari e gli acidi grassi a catena corta (SCFA) ); marcatori della funzione mitocondriale (ad esempio, β-idrossibutirrato, acilcarnitine/acilCoA, intermedi del ciclo TCA); amminoacidi nei campioni fecali [amminoacidi a catena ramificata, triptofano e metaboliti del triptofano correlati alla crescita e allo stato infiammatorio, compresi quelli prodotti dal metabolismo batterico del triptofano (ad es. derivati ​​dell'acido indolacetico)].

Prelievo di campioni di sangue:

Saranno raccolti 2 ml di campioni di sangue ciascuno da ogni bambino prima dell'intervento e subito dopo il completamento dell'intervento.15 partecipanti allo studio / braccio e 3 bracci, nello Studio 3 saranno raccolti un totale di 90 campioni di sangue.

Al fine di costruire una biblioteca del microbiota intestinale di bambini sani in crescita della stessa comunità, verranno raccolti un campione fecale spot (1-2 gm) e un campione di sangue spot (2 ml) da 30 bambini ciascuno di età compresa tra 12 e 18 anni mesi di entrambi i sessi, con WLZ e LAZ: >-1. Ciò avverrà solo dopo aver ottenuto il consenso dei partecipanti allo studio.

Attraverso il nostro lavoro di laboratorio iniziale e studi precedenti condotti su animali gnotobiotici nel Washington University Center for Genome Science ci ha portato a suggerire che una combinazione di ingredienti alimentari (ceci, farina di soia, arachidi e banana verde) con o senza latte in polvere sarà vale la pena studiare rispetto all'impatto della dieta sulla stimolazione della proliferazione del microbiota discriminatorio della crescita, nonché sui costi e sulla sostenibilità.

Ai partecipanti allo studio verrà chiesto di venire quotidianamente al centro di alimentazione designato per la terapia nutrizionale per evitare il problema della condivisione del cibo. Verrà fornito loro un numero di telefono per contattare il personale della clinica e un membro del personale può visitare la famiglia di una famiglia per una terapia nutrizionale osservata direttamente previo accordo, se necessario.

I questionari sulla frequenza alimentare di cinque giorni saranno completati al momento dell'arruolamento, prima della randomizzazione e settimanalmente durante l'intero periodo di studio.

Preparazione di diversi MDCF:

Preparazione di alimenti complementari per studi clinici Pre-POC:

Sulla base di combinazioni compatibili di ingredienti alimentari complementari identificati negli studi preclinici sopra descritti, i ricercatori progetteranno e produrranno 5 prototipi MDCF presso il Laboratorio di trasformazione alimentare icddr,b in quantità sufficienti per gli studi clinici (3 prototipi MDCF per Studio 1, 2 prototipi MDCF per Studio 2 e il MDCF qualificato dallo Studio 2 per lo Studio 3). Queste formulazioni saranno abbinate in densità energetica e contenuto di micronutrienti con alimenti supplementari pronti all'uso (RUSF) utilizzati per MAM in Bangladesh e in altri paesi e soddisferanno tutti gli altri requisiti locali per un alimento complementare/supplementare per bambini di 12-18 mesi bambini con MAM e arresto della crescita. L'icddr,b Food Processing Laboratory produrrà anche l'attuale standard di cura RUSF riso-lenticchia utilizzato per il trattamento di questi bambini per l'uso negli studi 1 e 3.

Sviluppo del prodotto

1. Identificazione degli ingredienti alimentari: ingredienti alimentari disponibili localmente, inclusi quelli identificati negli studi preclinici sull'oscillazione della dieta (ad es. ceci, farina di soia, arachidi, banana cruda, olio di soia, zucchero e con e senza latte in polvere) saranno utilizzati per produrre prototipi di MDCF.

   Gli MDCF saranno arricchiti con una premiscela di vitamine e minerali per soddisfare i requisiti di micronutrienti per gli alimenti supplementari in Bangladesh (vedi sotto).

2. Esperimenti sullo sviluppo di ricette: la formulazione teorica dei componenti MDCF deve essere effettuata sulla base di una programmazione lineare per identificare le combinazioni di ingredienti che risulteranno nelle ricette più nutrienti. La densità energetica di MDCF è mirata a ~ 5 kcal/g e la distribuzione calorica è mirata a essere il 45-50% dai grassi e l'8-12% dalle proteine. Sulla base dell'opinione degli esperti e del consenso all'interno del gruppo di ricerca, il contenuto di micronutrienti deve essere fissato per coprire il 70% del fabbisogno dei bambini non SAM di età compresa tra 12 e 18 mesi. Gli esperimenti per lo sviluppo di ricette e la preparazione di campioni saranno condotti presso il laboratorio di trasformazione alimentare icddr,b seguendo una procedura di produzione standardizzata per controllare la qualità dell'MDCF da ogni lotto di produzione e garantire che durante la lavorazione non si verifichino contaminazioni impreviste e perdite di nutrienti. Tutti gli ingredienti saranno puliti e ordinati. Le potenziali ricette devono essere prodotte in piccoli lotti dopo (cottura/cottura a vapore/tostatura secondo necessità per ciascuno degli ingredienti) e mescolando tutti gli ingredienti in un frullatore elettrico. Quando necessario, la consistenza delle ricette deve essere regolata variando la quantità di ingredienti secchi e olio di soia. Inoltre, la combinazione di minerali e vitamine deve essere regolata in caso di gusto sgradevole dovuto all'aggiunta di dosi elevate di micronutrienti. Una piccola quantità (1%) di lecitina di soia deve essere aggiunta alla ricetta per migliorare la consistenza e prevenire la separazione dell'olio.
3. Valutazione delle proprietà organolettiche delle ricette: Le nuove ricette saranno valutate per aspetto, sapore, consistenza delle diete e grado di gradimento complessivo utilizzando la scala edonica a 7 punti. Il valore più alto, ovvero 7, verrà classificato come "mi piace molto" e il valore più basso pari a 1 verrà classificato come "non mi piace di più".
4. Studio dei problemi di sicurezza alimentare e durata di conservazione: gli investigatori valuteranno la stabilità del prodotto, inclusa la qualità microbiologica, per ottenere le informazioni chiave necessarie per stabilire la data iniziale di "consumo da consumarsi preferibilmente entro" e valutare la stabilità del contenuto di vitamine e minerali e il potenziale di ossidazione. Test microbiologici standard (conta vitale totale, lieviti, muffe, coliformi, Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococci, Listeria monocytogenes, Cronobacter sakazaki) saranno eseguiti presso il laboratorio di sicurezza alimentare dell'icddr,b.
5. Finalizzazione di 5 prototipi di MDCF per gli studi clinici pre-POC: sulla base di tutti i criteri sopra menzionati, il nostro team di ricercatori selezionerà 5 MDCF per gli studi di accettabilità. i ricercatori stimeranno anche il costo/kg degli ingredienti dei candidati MDCF.

Formazione del personale sul campo Verrà fornita formazione a tutti i membri del team sul campo sulle diverse procedure relative alla raccolta dei campioni di feci. La formazione sarà facilitata da un gruppo ristretto di formatori e ricercatori dello studio.

Antropometria:

L'età del bambino sarà verificata sulla base della documentazione (certificato di nascita o carta di immunizzazione, se disponibile) o del rapporto del caregiver sulla data di nascita del bambino. La lunghezza sarà misurata con un infantometro sensibile a 0,1 cm (SECA, modello n. 4161721009, Amburgo, Germania). Il peso corporeo sarà misurato con una bilancia sensibile a 2 g (SECA 7281321009, Amburgo, Germania). I punteggi Z per lunghezza per età (LAZ), peso per lunghezza (WLZ) e peso per età (WAZ) saranno calcolati seguendo gli standard di crescita dell'OMS del Multicentre Growth Reference Study (MGRS) 11. L'edema verrà esaminato premendo la parte superiore di entrambi i piedi per 3 secondi. La circonferenza medio-superiore del braccio (MUAC) verrà misurata utilizzando il nastro TALC MUAC (Regno Unito). Standardizzazione delle apparecchiature di misurazione: verrà eseguita una standardizzazione regolare della bilancia per neonati e della tavola di lunghezza/lunghezza con un peso e una lunghezza noti.

Analisi di campioni plasmatici e fecali

I campioni di plasma raccolti in questo studio esplorativo pre-POC saranno inviati al laboratorio di Jeffrey Gordon situato nel Center for Genome Sciences and Systems Biology presso la Washington University di St. Louis. Saranno utilizzati metodi avanzati basati sulla spettroscopia di massa e sull'analisi immunologica per ottenere nuove conoscenze sul ruolo dell'immaturità del microbiota intestinale e sugli effetti del tentativo di riparazione acuta di questa immaturità con prototipi di alimenti complementari diretti dal microbiota di piombo (MDCF) su biomarcatori e mediatori di alimenti sani crescita.

Questo test iniziale degli effetti degli MDCF sull'immaturità del microbiota e sulle risposte dell'ospite all'intervento dietetico fornirà set di dati chiave che consentiranno un calcolo della potenza per il nostro studio di prova del concetto pianificato in una popolazione più ampia. Nell'attuale pre-POC esplorativo ogni bambino in ciascun gruppo di 12-15 partecipanti allo studio fungerà da controllo di se stesso. Verranno effettuati ulteriori confronti all'interno e tra i quattro gruppi di trattamento (ovvero quelli che consumano lo standard RUSF di riferimento e una delle tre diverse formulazioni di MDCF).

Le feci sarebbero state raccolte settimanalmente da ciascun partecipante allo studio durante il corso dello studio di 8 settimane, comprese le 2 settimane prima del trattamento, le quattro settimane durante il trattamento e le due settimane successive alla cessazione del trattamento. Inoltre, un campione di sangue da 2 ml verrebbe prelevato appena prima di iniziare l'intervento MDCF di 4 settimane e proprio quando l'intervento di 4 settimane è completato.

Saranno utilizzate la cromatografia liquida ultra performante-spettrometria di massa (UPLC-MS) e la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) per profilare analiti di interesse specifico in campioni di plasma e/o fecali, inclusi gli acidi biliari e gli acidi grassi a catena corta (SCFA) ); marcatori della funzione mitocondriale (ad esempio, β-idrossibutirrato, acilcarnitine/acilCoA, intermedi del ciclo TCA); amminoacidi nel siero più campioni fecali [amminoacidi a catena ramificata, triptofano e metaboliti del triptofano correlati alla crescita e allo stato infiammatorio, compresi quelli prodotti dal metabolismo batterico del triptofano (ad es. derivati ​​dell'acido indolacetico)].

Inoltre, i principali mediatori/biomarcatori della crescita lineare (ad es. ormone della crescita e IGF-1), dell'utilizzo energetico (insulina, leptina) e della biologia ossea [IL-6, osteoprotegerina, il peptide C-terminale del collagene di tipo I (CTX , un marcatore di attività osteoclastica/riassorbimento osseo) e il propeptide ammino-terminale del procollagene di tipo 1 (P1NP, un marcatore di attività osteoblastica/formazione ossea)], e l'infiammazione sistemica (CRP, AGP) saranno quantificati mediante test ELISA/ Saggi Luminex.

Le informazioni raccolte saranno utilizzate per selezionare campioni fecali umani per il trapianto in animali privi di germi; questi animali, che saranno nutriti con le diete dei loro donatori di microbiota umano, saranno utilizzati per caratterizzare ulteriormente i meccanismi che collegano i prototipi di MDCF, il microbiota intestinale e la fisiologia/metabolismo dell'ospite. Inoltre, questi biomarcatori plasmatici e fecali saranno utilizzati per determinare le caratteristiche dei nostri modelli preclinici che sono meglio correlate con le risposte nei bambini; questa conoscenza aiuterà a informare la progettazione di prototipi MDCF di prossima generazione con un'efficacia superiore sui risultati di crescita.

Calcolo della dimensione del campione:

L'esito primario di questo studio sarà la variazione del punteggio Microbiota-for-Age Z (ΔMAZ) dopo 4 settimane di intervento. Il nostro lavoro precedente5 ha mostrato che la MAZ media dei bambini di 18 mesi con MAM era -1,60+ 0,36 (SEM) mentre per i bambini sani della stessa età, la MAZ media era -0,52+0,22, con una differenza tra le medie di 1,08+0,41. Utilizzando la funzione power.t.test di R per un t-test accoppiato (ad es. accoppiando campioni di un bambino prima e dopo l'intervento), con una SD presunta di 1 e un'ipotesi unilaterale, 15 bambini in ciascun braccio ci consentiranno di catturare un miglioramento della MAZ di> 0,7 con una potenza dell'80% e una soglia di significatività di 0,05. Gli investigatori quindi prevedono di essere sufficientemente potenziati per rilevare con sicurezza un cambiamento nella MAZ dell'entità che ha distinto il microbiota dei bambini sani da quello nei bambini con MAM nel nostro studio precedente

Analisi dei dati :

L'analisi dei dati verrà eseguita con lo stesso approccio utilizzato per il calcolo della maturità del microbiota e l'applicazione di questi strumenti in uno studio di intervento RUTF precedente sul trattamento di bambini con SAM presso icddr,b5.

La misura dell'esito primario in ogni studio è la variazione media indotta dal trattamento nel punteggio MAZ rispetto al basale per ciascun braccio dello studio. Le differenze (IC al 95%) tra i mezzi dei bracci di trattamento saranno valutate utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dall'HSD di Tukey o da un test post hoc simile (se appropriato). Il prototipo MDCF con la dimensione media dell'effetto più grande in questi studi pre-POC e le proprietà organolettiche accettabili saranno selezionati per lo studio clinico POC successivo per esaminare i risultati clinici nei bambini con MAM post-SAM.