유방암과 미생물군과의 관계 (MICROMA)

이 연구는 헬싱키 선언과 임상 연구에 관한 스페인 법률을 따를 것입니다. 획득한 데이터는 기밀로 유지되며 요청 시 연구원과 참가자만 액세스할 수 있습니다. 이 연구는 또한 데이터 기밀성, 처리 및 가용성을 보장하기 위해 스페인의 데이터 보호법을 따를 것입니다.

참여는 자원봉사입니다. 참가자는 연구의 성격과 생물학적 샘플의 사용에 대해 알릴 것입니다. 구두 정보 외에도 참가자는 정보에 입각한 동의서를 제시하고 읽습니다. 안달루시아 윤리위원회(스페인)의 허가를 받았습니다.

포함 및 제외 기준. 여성의 나이는 25-70세입니다. 사례는 I기 및 II기 유방암으로 진단되고 외과적으로 개입된 여성이 될 것입니다. 컨트롤은 외과적으로 유방 확대 또는 축소에 개입된 여성이 될 것입니다. 암 또는 진행성 종양 단계(전이)의 전조가 있는 여성 또는 모집 3개월 전에 항생제 치료를 받은 여성 또는 임의의 신보강 요법은 연구에서 제외됩니다. 종양학, 부인과 또는 내분비계 질환이 있거나 모집 3개월 전에 항생제 치료를 받은 여성도 제외됩니다. 대조군은 연령(±2세), 체질량 지수 범주 및 모집 병원별로 사례에 일치됩니다.

표본의 크기. 유방암 사례의 수에는 100명의 대조군 여성과 일치하는 최소 100명의 여성이 포함됩니다. 3개 병원이 모집에 참여할 예정입니다: 스페인 Jaén 대학 병원; 스페인 그라나다 대학 병원 Campus de la Salud; 및 Ana Moreno Clinic(스페인 그라나다).

생물학적 샘플. 사례 및 대조군의 혈액, 유방 조직, 대변 및 소변 샘플을 수집합니다. 혈청은 원심 분리에 의해 혈액에서 분리됩니다. 유방 조직 샘플은 수술 중 종양에서 3-5cm 떨어져 있는 변연부에서 채취합니다. 컨트롤을 위해 유방 축소 또는 확대 수술 중에 사용 가능한 모든 유방 조직에서 샘플을 채취합니다.

유방 및 장내 미생물. 박테리아, 고세균, 곰팡이 및 바이러스는 대변 및 유방 조직 샘플에서 조사됩니다. 샘플은 병원체 용해 튜브 L 및 S(QIAGEN, Barcelona, ​​Spain)로 전처리됩니다. DNA는 QIAamp cador Pathogen Mini 키트(QIAGEN, Barcelona, ​​Spain)로 추출됩니다.

DNA 정량화. 샘플의 DNA 농도는 NanoDrop2000c(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 평가됩니다.

Metagenomic 라이브러리 구성 및 시퀀싱. Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트(Illumina, San Diego, CA, USA)는 metagenomic 라이브러리 구성에 사용됩니다. 태깅에 사용되는 효소를 포함하는 Nextera XT의 amplicon tagment mix(ATM)는 1~100pg 입력 DNA를 사용하여 라이브러리 구성을 위해 뉴클레아제가 없는 물에 1:10으로 희석됩니다. 각 20 μL의 태그화 반응 혼합물은 10 μL TD 완충액, 5 μL의 입력 DNA 및 5 μL의 희석된 ATM으로 구성됩니다. 라이브러리 구성을 위한 PCR 주기는 제조업체의 프로토콜에 따라 각각 1,000, 100, 10 및 1pg DNA에 대해 12, 14, 17 및 20주기입니다. 제조업체는 1ng 이상의 입력 DNA에 대해 12주기의 PCR 반응을 권장합니다. 증폭된 라이브러리는 AMPure XP(Agencourt, Brea, CA, USA)를 사용하여 정제됩니다. 정제된 라이브러리의 품질은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Santa Clara, CA, USA)에서 Agilent 고감도 DNA 키트를 사용하여 평가됩니다. 시퀀싱 라이브러리는 KAPA 라이브러리 정량화 키트를 사용하여 추가로 정량화됩니다. Metagenomic 라이브러리는 PhiX Control v3(Illumina)와 9:1의 비율로 혼합되고 Illumina MiSeq Reagent Kit v3(600주기)로 시퀀싱됩니다. 분석할 모든 샘플은 대량 시퀀싱을 시작하기 전에 풀에서 결합됩니다. 후자는 MiSeq 장치(Illumina)로 수행됩니다.

metagenomic 라이브러리를 위한 데이터 처리. Metagenomic 판독은 Trimmomatic v0.3을 사용하여 어댑터 클리핑 및 품질 트리밍에 적용됩니다. 품질 점수가 20 미만인 처음 3개의 뉴클레오티드는 3' 및 5' 읽기 끝에서 절단됩니다. 읽기는 슬라이딩 윈도우 방법을 사용하여 처리되며 윈도우(4 베이스) 내의 평균 품질이 임계값(Q20) 아래로 떨어지면 절단됩니다. 100개 미만의 뉴클레오티드 길이를 가진 읽기는 제거됩니다. 복잡성이 낮은 읽기는 PRINSEQ 버전 0.20.4를 사용하여 필터링됩니다. PCR 중복은 Picard 버전 2.8.0(http://broadinstitute.github.io/picard)에서 제거됩니다. 각 라이브러리에서 처리된 고품질 및 클린 읽기는 후속 분석에 사용됩니다. metagenomic sequence 기반 커뮤니티 분석에서는 Metaxa2 소프트웨어를 사용하여 SSU(small subunit) rRNA 유전자 염기서열을 식별합니다. 분류 할당은 다음 설정과 함께 MEGAN 프로그램[23]을 사용하여 SILVA123 데이터베이스에 대한 BLAST 검색 결과를 기반으로 수행됩니다: Min Support 1, Min Score 50, Max Expected 1xe-5, Top Percent 10.0. SSU rRNA 유전자 커뮤니티 구성은 metagenomic 라이브러리 중에서 비교되었습니다.

대사 연구. 샘플 준비. 샘플은 자동화된 MicroLab STARR(Hamilton Company, Salt Lake City, UT, USA) 로봇 시스템을 사용하여 준비됩니다. 품질 관리(QC) 목적을 위해 추출 과정의 첫 번째 단계 전에 회수 표준을 혈청 샘플 100L에 추가합니다. 단백질은 2분 동안 격렬하게 흔들어 메탄올로 침전됩니다. 다음으로, 샘플을 원심분리하여 단백질을 제거하고, 단백질에 결합되거나 침전된 단백질 매트릭스에 포획된 작은 분자를 분리하고, 화학적으로 다양한 대사산물을 회수합니다(Glen Mills GenoGrinder 2000, Lebanon, USA). 그런 다음 시료를 TurboVapR(Zymark, California, USA)에 올려 유기 용매를 제거합니다. 액체 크로마토그래피(LC) 분석의 경우 샘플을 준비하기 전에 밤새 질소에 보관합니다. 가스 크로마토그래피(GC) 분석을 위해 각 샘플은 준비 전에 진공 하에서 밤새 건조됩니다.

품질 관리. 여러 유형의 제어 실험이 실험 샘플과 병행하여 수행됩니다. 각 실험 샘플의 소량을 취하여 생성된 풀링된 매트릭스 샘플은 추출된 데이터 세트 전체에서 기술적 복제 역할을 합니다. 물 분취량은 프로세스 블랭크로 사용됩니다. 또한 내인성 화합물의 측정을 방해하지 않도록 신중하게 선택된 QC 표준 혼합물이 모든 분석 샘플에 첨가됩니다. 이를 통해 기기 성능을 모니터링하고 크로마토그래피 정렬을 지원할 수 있습니다. 기기 변동성은 질량 분석기(MS)에 주입하기 전에 각 샘플에 추가될 표준에 대한 중간 상대 표준 편차(RSD)를 계산하여 결정됩니다. 전체 공정 변동성은 풀링된 매트릭스 샘플의 100%에 존재하는 모든 내인성 대사산물(즉, 비기기 표준물질)에 대한 중앙값 RSD를 계산하여 결정됩니다. 실험 샘플은 전체 분석 성능을 확인하기 위해 5회 또는 10회 주사마다 간격을 둔 QC 샘플과 함께 실행되는 플랫폼 전체에서 무작위로 추출됩니다. 내부 표준은 기기 변동성을 측정하는 데 사용되며 RSD 중앙값은 3%입니다. 또한 전체 공정 변동성은 8%입니다.

초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법. 사용할 플랫폼의 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS) 부분은 Waters ACQUITY 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC), Thermo Scientific Q-Exactive 고분해능/정확한 MS(가열 전기분무 이온화 장치와 연결됨)를 사용합니다. HESI-II) 소스 및 35,000 질량 분해능에서 작동하는 Orbitrap 질량 분석기. 샘플 추출물은 건조되고 산성 또는 염기성 LC 호환 용매에서 재구성되며, 각 용매에는 주입 및 크로마토그래피 일관성을 보장하기 위해 고정 농도에서 8개 이상의 주입된 QC 표준이 포함됩니다. 하나의 분취량은 산성, 양이온 최적화 조건을 사용하여 분석하고, 다른 하나는 별도의 전용 컬럼(Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100mm, 1.7m)을 사용하여 두 번의 독립적인 주입으로 염기성, 음이온 최적화 조건을 사용하여 수행합니다. 산성 조건에서 재구성된 추출물은 0.1% 포름산을 함유한 물과 메탄올을 사용하여 C18 컬럼에서 구배 용출됩니다. 기본 추출물의 두 번째 분취량은 메탄올, 물 및 6.5mM 중탄산암모늄을 사용하여 C18 컬럼에서 유사하게 용출됩니다. 세 번째 분취량은 친수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼(Waters UPLC BEH Amide 2.1 × 150mm, 1.7m)에서 용출 후 음이온화를 통해 분석됩니다.

가스 크로마토그래피-질량 분석. GC-MS에 의한 분석을 위한 샘플은 비스트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드로 건조된 질소 하에서 유도체화되기 전에 최소 18시간 동안 진공 하에서 건조될 것입니다. 유도체화된 샘플은 헬륨을 운반 가스로 사용하고 17.5°C에서 60°C에서 340°C까지의 온도 램프를 사용하여 5% 디페닐/95% 디메틸 폴리실록산 용융 실리카 컬럼(20m × 0.18mm id, 0.18m 필름 두께)에서 분리됩니다. 최소 기간. 샘플은 단위 질량 분해능에서 작동하는 전자 충격 이온화(EI)를 사용하여 Thermo-Finnigan Trace DSQ 고속 스캐닝 단일 사중극자 MS에서 분석됩니다. 스캔 범위는 50-750m/z입니다.

데이터 추출 및 화합물 식별. 원시 데이터가 추출되고 피크가 정렬되고 식별됩니다. QC는 특정 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하여 처리됩니다. 피크는 곡선 아래 영역(AUC) 계산을 사용하여 정량화됩니다. 화합물은 데이터를 정제된 표준 또는 반복적인 미지의 개체의 라이브러리 항목과 비교하여 식별됩니다. 생화학적 식별은 세 가지 기준을 기반으로 합니다: 제안된 식별의 좁은 RI 창 내 보유 지수(RI), 라이브러리 ± 0.005 amu에 대한 정확한 질량 일치, 실험 데이터 간의 MS/MS 순방향 및 역방향 점수 그리고 진정한 기준. MS/MS 점수는 실험 스펙트럼에 존재하는 이온과 라이브러리 스펙트럼에 존재하는 이온의 비교를 기반으로 합니다. 이러한 요소 중 하나를 기반으로 이러한 분자 간에 유사성이 있을 수 있지만 세 가지 데이터 포인트 모두를 사용하여 생화학 물질을 정확하게 구별하고 차별화할 수 있습니다.

소변 샘플에서 EDC에 대한 노출 정량화. 비지속적 EDC의 분석은 분산형 액체-액체 마이크로 추출(DLLME) 및 탠덤 질량 분석법 검출 기능이 있는 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC-MS/MS)에 의해 수행됩니다. 간략하게, 소변 샘플을 실온에서 완전히 해동하고, 2600 x g에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 미립자 물질을 침전시키고 0.75 mL를 취하여 분석을 수행합니다. 총 EDC 양(유리 + 접합)을 결정하기 위해 각 샘플에 50μL의 효소 용액(β-글루쿠로니다아제/설파타아제)을 첨가하고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다. 처리된 소변을 15mL 스크류 캡 유리관에 넣고 30μL의 대용 표준 용액(1.25mg/L의 BPA-d16)을 첨가합니다. 소변을 5% NaCl 수용액(w/v)으로 10.0mL로 희석하고 pH를 2.0으로 조정합니다. 다음으로 0.75mL의 아세톤과 0.75mL의 트리클로로메탄을 혼합하고 주사기로 수용액 시료에 빠르게 주입합니다. 수동 진탕, 원심분리 및 추출물의 증발 후, 잔류물을 물(0.1% 암모니아)/아세토니트릴(0.1% 암모니아), 70:30(v/v) 및 마지막으로 10μL로 구성된 혼합물 100μL로 용해합니다. LC 시스템에 주입됩니다. 소변 크레아티닌 농도는 환경 화학 물질이 평가되는 동일한 소변 샘플에서 자동 비색 측정을 사용하여 결정됩니다.

부모 에스트로겐 및 에스트로겐 대사 산물의 소변 농도 정량화. 에스트론, 에스트라디올 및 13가지 에스트로겐 대사물의 농도는 소변 크레아티닌 수치(mg/dl)를 조정하여 결정됩니다. 소변 에스트로겐의 정량화는 삼중 사중극자 분석기를 사용하는 가스 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법으로 평가됩니다. 간단히 말해서, 메탄올 4mL와 물 4mL로 이전에 컨디셔닝한 C18 SPE 카트리지(Sep-Pack C18)를 사용하여 내부 표준 용액 25µL와 함께 소변 1mL를 추출합니다. 소변 샘플을 로드한 후 카트리지를 4mL의 물로 세척합니다. 그런 다음 처리된 소변을 증발시킵니다. 아세테이트 완충액 0.1M(pH 4.5) 3mL 및 β-글루쿠로니다아제 3μL를 증발물에 첨가하고 혼합물을 55℃에서 3시간 동안 배양한다. 실온으로 냉각한 후, pH를 약 9.5로 증가시켰다. 그런 다음 샘플을 tert-부틸 메틸 에테르 6 mL로 진탕 추출하고 원심 분리합니다. 마지막으로, 유기층을 질소 기류 하에서 증발 건조시킨다.

정보 및 공변량의 기타 출처. 참가자의 인체 측정, 사회인구학적 및 생식 기능이 기록됩니다. 또한 임상 기록에 액세스할 수 있는 권한도 부여합니다. 종양 특징 및 식이 습관이 기록될 것이다.