Cáncer de mama y su relación con la microbiota (MICROMA)

El estudio seguirá la Declaración de Helsinki y la legislación española en materia de investigación clínica. Los datos obtenidos serán confidenciales y sólo los investigadores y participantes, previa solicitud, tendrán acceso a ellos. El estudio seguirá también la legislación de protección de datos de España para garantizar la confidencialidad, el tratamiento y la disponibilidad de los datos.

La participación es voluntaria. Se informará a los participantes sobre la naturaleza de la investigación y el uso de muestras biológicas. Además de la información verbal, a los participantes se les presentará y leerá un consentimiento informado. Ha sido autorizado por el Comité de Ética de Andalucía (España).

Los criterios de inclusión y exclusión. La edad de las mujeres oscilará entre los 25 y los 70 años. Los casos serán mujeres diagnosticadas e intervenidas quirúrgicamente de cáncer de mama incidente, estadios I y II. Los controles serán mujeres intervenidas quirúrgicamente de aumento o reducción mamaria. Se excluirán del estudio mujeres con antecedentes de cáncer o estadio tumoral avanzado (metástasis), o que hayan recibido tratamiento antibiótico 3 meses antes del reclutamiento, o cualquier terapia neoadyuvante. También se excluirán mujeres con antecedentes oncológicos, ginecológicos o endocrinos y aquellas que hayan recibido tratamiento antibiótico 3 meses antes de la contratación. Los controles se emparejarán con los casos por edad (± 2 años), categoría de índice de masa corporal y hospital de reclutamiento.

Tamaño de la muestra. El número de casos de cáncer de mama incluirá al menos 100 mujeres, emparejadas con 100 mujeres de control. En el reclutamiento participarán tres hospitales: el Hospital Universitario de Jaén, España; el Hospital Universitario Campus de la Salud de Granada, España; y Clínica Ana Moreno (Granada, España).

Muestras biológicas. Se recolectarán muestras de sangre, tejido mamario, heces y orina de casos y controles. El suero se separará de la sangre por centrifugación. Se tomarán muestras de tejido mamario durante la cirugía, de un área marginal a 3-5 cm del tumor. Para los controles, se tomarán muestras de cualquier tejido mamario disponible durante la cirugía de aumento o reducción mamaria.

Microbiota mamaria e intestinal. Se investigarán bacterias, arqueas, hongos y virus en heces y muestras de tejido mamario. Las muestras serán pretratadas con tubos de lisis de patógenos L y S (QIAGEN, Barcelona, ​​España). El ADN se extraerá con el kit QIAamp cador Pathogen Mini (QIAGEN, Barcelona, ​​España).

cuantificación de ADN. La concentración de ADN de las muestras se evaluará en un NanoDrop2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

Construcción y secuenciación de bibliotecas metagenómicas. El kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) se utilizará para la construcción de bibliotecas metagenómicas. La mezcla de etiquetas de amplicón (ATM) en Nextera XT, que incluye la enzima utilizada para la etiquetación, se diluirá 1:10 en agua libre de nucleasas para la construcción de bibliotecas utilizando de 1 a 100 pg de ADN de entrada. Cada 20 μL de la mezcla de reacción de tagmentación consta de 10 μL de tampón TD, 5 μL de ADN de entrada y 5 μL de ATM diluido. Los ciclos de PCR para la construcción de bibliotecas serán de 12, 14, 17 y 20 ciclos para 1000, 100, 10 y 1 pg de ADN, respectivamente, siguiendo el protocolo del fabricante. El fabricante recomienda 12 ciclos de la reacción de PCR para no menos de 1 ng de ADN de entrada. Las bibliotecas amplificadas se purificarán utilizando AMPure XP (Agencourt, Brea, CA, EE. UU.). La calidad de las bibliotecas purificadas se evaluará utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad de Agilent en un bioanalizador Agilent 2100 (Santa Clara, CA, EE. UU.). Las bibliotecas de secuenciación se cuantificarán aún más utilizando el KAPA Library Quantification Kit. Las bibliotecas metagenómicas se mezclarán con PhiX Control v3 (Illumina) en una proporción de 9:1 y se secuenciarán con un Illumina MiSeq Reagent Kit v3 (600 ciclos). Todas las muestras a analizar se combinarán en un pool antes de iniciar la secuenciación masiva. Esto último se hará con el aparato MiSeq (Illumina).

Procesamiento de datos para bibliotecas metagenómicas. Las lecturas metagenómicas estarán sujetas a recorte de adaptador y recorte de calidad utilizando Trimmomatic v0.3. Los tres primeros nucleótidos con puntuaciones de calidad inferiores a 20 se eliminarán de los extremos de lectura 3' y 5'. Las lecturas se procesarán mediante un método de ventana deslizante, cortando una vez que la calidad promedio dentro de la ventana (base 4) caiga por debajo del umbral (Q20). A continuación, se eliminarán las lecturas con una longitud inferior a 100 nucleótidos. Las lecturas de baja complejidad se filtrarán mediante PRINSEQ versión 0.20.4. Los duplicados de PCR se eliminarán con Picard versión 2.8.0 (http://broadinstitute.github.io/picard). Las lecturas limpias y de alta calidad procesadas en cada biblioteca se utilizarán en análisis posteriores. En el análisis comunitario basado en secuencias metagenómicas, las secuencias de genes de ARNr de subunidades pequeñas (SSU) se identificarán utilizando el software Metaxa2. Las asignaciones de taxonomía se realizarán en función de los resultados de una búsqueda BLAST en la base de datos SILVA123, utilizando el programa MEGAN [23] con las siguientes configuraciones: Min Support 1, Min Score 50, Max Expected 1xe-5, Top Percent 10.0. Las composiciones de la comunidad de genes SSU rRNA se compararon entre las bibliotecas metagenómicas.

Estudio metabolómico. Preparación de la muestra. Las muestras se prepararán utilizando el sistema de robot automatizado MicroLab STARR (Hamilton Company, Salt Lake City, UT, EE. UU.). Para fines de control de calidad (QC), se agregará un estándar de recuperación a 100 L de las muestras de suero antes del primer paso en el proceso de extracción. Las proteínas se precipitarán con metanol agitando vigorosamente durante 2 min. A continuación, las muestras se centrifugarán para eliminar las proteínas, disociar las pequeñas moléculas unidas a las proteínas o atrapadas en la matriz proteica precipitada y recuperar metabolitos químicamente diversos (Glen Mills GenoGrinder 2000, Líbano, EE. UU.). Luego, las muestras se colocarán en un TurboVapR (Zymark, California, EE. UU.) para eliminar el solvente orgánico. Para el análisis de cromatografía líquida (LC), las muestras se almacenarán durante la noche en nitrógeno antes de la preparación. Para el análisis de cromatografía de gases (GC), cada muestra se secará durante la noche al vacío antes de la preparación.

Controles de calidad. Se realizarán varios tipos de experimentos de control en paralelo con las muestras experimentales. Una muestra de matriz agrupada, generada tomando un pequeño volumen de cada muestra experimental, servirá como una réplica técnica de todo el conjunto de datos extraído. Las alícuotas de agua servirán como blancos de proceso. Además, se añadirá a cada muestra analizada un cóctel de estándares de control de calidad elegidos cuidadosamente para que no interfieran con la medición de compuestos endógenos. Esto permitirá monitorear el desempeño del instrumento y ayudar en la alineación cromatográfica. La variabilidad del instrumento se determinará calculando la desviación estándar relativa (RSD) mediana de los estándares que se agregarán a cada muestra antes de la inyección en los espectrómetros de masas (MS). La variabilidad del proceso completo se determinará calculando la RSD mediana para todos los metabolitos endógenos (es decir, estándares que no son de instrumentos) presentes en el 100 % de las muestras de matriz agrupadas. Las muestras experimentales se aleatorizarán a lo largo de la ejecución de la plataforma con las muestras de control de calidad espaciadas cada 5 o 10 inyecciones para verificar el rendimiento general del ensayo. Los patrones internos se utilizarán para medir la variabilidad del instrumento y tendrán una RSD mediana del 3%. Adicionalmente, la variabilidad total del proceso será del 8%.

Cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas en tándem. La porción de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) de la plataforma que se utilizará empleará una cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Waters ACQUITY, un MS Thermo Scientific Q-Exactive de alta resolución/preciso interconectado con una ionización por electropulverización calentada ( HESI-II) y un analizador de masas Orbitrap operado a una resolución de 35.000 masas. El extracto de muestra se secará y reconstituirá en disolventes compatibles con LC ácidos o básicos, cada uno de los cuales contendrá ocho o más estándares de control de calidad inyectados en concentraciones fijas para garantizar la consistencia cromatográfica y de inyección. Una alícuota se analizará en condiciones ácidas optimizadas con iones positivos y otra se realizará en condiciones básicas optimizadas con iones negativos en dos inyecciones independientes usando columnas dedicadas separadas (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 m). Los extractos reconstituidos en condiciones ácidas se eluirán en gradiente de una columna C18 utilizando agua y metanol que contiene ácido fórmico al 0,1 %. Una segunda alícuota, del extracto básico, se eluirá de manera similar de una columna C18 utilizando metanol, agua y bicarbonato de amonio 6,5 mM. Se analizará una tercera alícuota mediante ionización negativa después de la elución de una columna de cromatografía de interacción hidrófila (Waters UPLC BEH Amide 2,1 × 150 mm, 1,7 m) utilizando un gradiente que consta de agua y acetonitrilo con formiato de amonio 10 mM.

Cromatografía de gases-espectrometría de masas. Las muestras destinadas a análisis por GC-MS se secarán al vacío durante un mínimo de 18 h antes de derivatizarse en nitrógeno seco con bistrimetilsililtrifluoroacetamida. Las muestras derivadas se separarán en una columna de sílice fundida con 5 % de difenilo/95 % de dimetilpolisiloxano (20 m × 0,18 mm de d.i.; 0,18 m de espesor de película) con helio como gas portador y una rampa de temperatura de 60 °C a 340 °C en un rango de 17,5- período mínimo. Las muestras se analizarán en un MS de un solo cuadrupolo de escaneo rápido Thermo-Finnigan Trace DSQ que utiliza ionización por impacto de electrones (EI) operada a una potencia de resolución de masa unitaria. El rango de exploración será de 50-750 m/z.

Extracción de datos e identificación de compuestos. Se extraerán los datos sin procesar y se alinearán e identificarán los picos. Los controles de calidad se procesarán utilizando hardware y software específicos. Los picos se cuantificarán mediante el cálculo del área bajo la curva (AUC). Los compuestos se identificarán comparando los datos con las entradas de la biblioteca de estándares purificados o entidades desconocidas recurrentes. Las identificaciones bioquímicas se basarán en tres criterios: el índice de retención (RI) dentro de una ventana de RI estrecha de la identificación propuesta, una coincidencia de masa precisa con la biblioteca ± 0,005 amu y las puntuaciones MS/MS hacia adelante y hacia atrás entre los datos experimentales y estándares auténticos. Las puntuaciones de MS/MS se basarán en una comparación de los iones presentes en el espectro experimental con los iones presentes en el espectro de la biblioteca. Aunque puede haber similitudes entre estas moléculas en función de uno de estos factores, el uso de los tres puntos de datos se puede utilizar para distinguir y diferenciar los productos bioquímicos con precisión.

Cuantificación de la exposición a EDC en muestras de orina. El análisis de los EDC no persistentes se llevará a cabo mediante microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) y cromatografía líquida de ultra alta resolución con detección por espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). Brevemente, las muestras de orina se descongelan completamente a temperatura ambiente, se centrifugan a 2600 x g durante 10 min para sedimentar el material particulado y se toman 0,75 mL para realizar el análisis. Para determinar la cantidad total de EDC (libres más conjugados), se añaden 50 μL de solución enzimática (β-glucuronidasa/sulfatasa) a cada muestra y se incuba a 37 °C durante 24 h. La orina tratada se coloca en un tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL y se le añaden 30 μL de la solución estándar sustituta (1,25 mg/L de BPA-d16). La orina se diluye a 10,0 ml con una solución acuosa de NaCl al 5 % (p/v) y el pH se ajusta a 2,0. A continuación, se mezclan 0,75 mL de acetona y 0,75 mL de triclorometano y se inyectan rápidamente en la muestra acuosa con una jeringa. Tras agitación manual, centrifugación y evaporación del extracto, el residuo se disuelve con 100 μL de una mezcla formada por agua (0,1% amoniaco)/acetonitrilo (0,1% amoniaco), 70:30 (v/v), y finalmente 10 μL se inyecta en el sistema LC. La concentración de creatinina en orina se determina utilizando una determinación colorimétrica automatizada en las mismas muestras de orina en las que se evalúa la sustancia química ambiental.

Cuantificación de las concentraciones urinarias de los estrógenos originales y los metabolitos de los estrógenos. Las concentraciones de estrona, estradiol y 13 metabolitos de estrógeno se determinarán ajustando los niveles de creatinina urinaria (mg/dl). La cuantificación de los estrógenos urinarios se evaluará mediante espectrometría de masas en tándem con cromatografía de gases utilizando un analizador de triple cuadrupolo. Brevemente, se extrae un mL de orina con 25 µL de solución de estándares internos utilizando un cartucho C18 SPE (Sep-Pack C18) previamente acondicionado con 4 mL de metanol y 4 mL de agua. Después de cargar la muestra de orina, el cartucho se lava con 4 ml de agua. La orina tratada luego se evapora. Se añaden al evaporado 3 mL de tampón acetato 0,1 M (pH 4,5) y 3 µL de β-glucuronidasa, y la mezcla se incuba durante 3 ha 55 °C. Después de enfriar a temperatura ambiente, el pH se aumentó a aproximadamente 9,5. Luego, las muestras se extraen con 6 ml de terc-butil metil éter mediante agitación y centrifugación. Finalmente, la capa orgánica se evapora a sequedad bajo una corriente de nitrógeno.

Otras fuentes de información y covariables. Se registrarán las características antropométricas, sociodemográficas y reproductivas de los participantes. También otorgarán permiso para acceder a su historia clínica. Se registrarán las características del tumor y los hábitos alimentarios.