乳腺癌及其与微生物群的关系 (MICROMA)

该研究将遵循赫尔辛基宣言和西班牙关于临床研究的立法。 获得的数据将保密，只有研究人员和参与者可以根据要求访问这些数据。 该研究还将遵循西班牙的数据保护立法，以保证数据的机密性、处理和可用性。

参与是自愿的。 参与者将被告知研究的性质和生物样本的用途。 除了口头信息外，还将向参与者展示并阅读知情同意书。 安达卢西亚（西班牙）伦理委员会已获得许可。

纳入和排除标准。 女性的年龄范围为25-70岁。 病例将是被诊断出患有 I 期和 II 期乳腺癌并接受手术干预的女性。 对照将是手术干预隆胸或缩小的女性。 患有癌症或晚期肿瘤分期（转移）的女性，或在招募前 3 个月接受过抗生素治疗或任何新辅助治疗的女性，将被排除在研究之外。 具有肿瘤、妇科或内分泌病史的女性以及在招募前 3 个月接受过抗生素治疗的女性也将被排除在外。 对照将根据年龄（± 2 岁）、体重指数类别和招募医院与病例相匹配。

样本大小。 乳腺癌病例数将包括至少 100 名女性，与 100 名对照女性相匹配。 三家医院将参与招募：西班牙哈恩大学医院；西班牙格拉纳达的 University Hospital Campus de la Salud；和 Ana Moreno Clinic（西班牙格拉纳达）。

生物样本。 将收集病例和对照的血液、乳腺组织、粪便和尿液样本。 通过离心将血清与血液分离。 乳房组织样本将在手术期间从距离肿瘤 3-5 厘米的边缘区域采集。 对于对照，将在缩胸或隆胸手术期间从任何可用的乳房组织中采集样本。

乳房和肠道微生物群。 将在粪便和乳腺组织样本中研究细菌、古细菌、真菌和病毒。 样品将用病原体裂解管 L 和 S (QIAGEN, Barcelona,​​ Spain) 进行预处理。 将用 QIAamp cador Pathogen Mini 试剂盒（QIAGEN，巴塞罗那，西班牙）提取 DNA。

DNA 定量。 样品的 DNA 浓度将在 NanoDrop2000c（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中进行评估。

宏基因组文库构建和测序。 Nextera XT DNA Library Preparation Kit（Illumina，San Diego，CA，USA）将用于宏基因组文库构建。 Nextera XT 中的扩增子标记混合物 (ATM) 包括用于标记的酶，将在无核酸酶水中按 1:10 稀释，用于使用 1 至 100 pg 输入 DNA 构建文库。 每 20 μL 的标记反应混合物由 10 μL TD 缓冲液、5 μL 输入 DNA 和 5 μL 稀释的 ATM 组成。 按照制造商的协议，对于 1,000、100、10 和 1 pg DNA，文库构建的 PCR 循环将分别为 12、14、17 和 20 个循环。 制造商建议 12 个循环的 PCR 反应不少于 1 ng 输入 DNA。 将使用 AMPure XP (Agencourt, Brea, CA, USA) 纯化扩增的文库。 纯化文库的质量将在 Agilent 2100 生物分析仪（美国加利福尼亚州圣克拉拉）上使用 Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒进行评估。 测序文库将使用 KAPA 文库定量试剂盒进一步量化。 宏基因组文库将与 PhiX Control v3 (Illumina) 以 9:1 的比例混合，并使用 Illumina MiSeq Reagent Kit v3（600 个循环）进行测序。 在开始大规模测序之前，所有要分析的样本都将合并到一个池中。 后者将使用 MiSeq 设备 (Illumina) 完成。

宏基因组文库的数据处理。 宏基因组读数将使用 Trimmomatic v0.3 进行适配器剪裁和质量修整。 质量分数小于 20 的前三个核苷酸将从 3' 和 5' 读取端被切掉。 读取将使用滑动窗口方法进行处理，一旦窗口（4 个碱基）内的平均质量低于阈值 (Q20)，就会进行切割。 长度小于 100 个核苷酸的读数将被删除。 使用 PRINSEQ 版本 0.20.4 将过滤掉低复杂度的读取。 Picard 版本 2.8.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) 将删除 PCR 重复项。 每个库中经过处理的高质量和干净的读取将用于后续分析。 在基于宏基因组序列的群落分析中，将使用 Metaxa2 软件识别小亚基 (SSU) rRNA 基因序列。 分类分配将根据针对 SILVA123 数据库的 BLAST 搜索结果执行，使用 MEGAN 程序 [23]，设置如下：最小支持度 1，最小分数 50，最大预期 1xe-5，最高百分比 10.0。 在宏基因组文库中比较了 SSU rRNA 基因群落组成。

代谢组学研究。 样品制备。 样品将使用自动化 MicroLab STARR（汉密尔顿公司，美国犹他州盐湖城）机器人系统制备。 出于质量控制 (QC) 的目的，在提取过程的第一步之前，将向 100 L 血清样品中添加回收标准。 剧烈摇动 2 分钟，用甲醇沉淀蛋白质。 接下来，样品将被离心以去除蛋白质，解离与蛋白质结合或捕获在沉淀蛋白质基质中的小分子，并回收化学多样性的代谢物（Glen Mills GenoGrinder 2000，黎巴嫩，美国）。 然后，将样品放置在 TurboVapR（美国加利福尼亚州 Zymark）上以去除有机溶剂。 对于液相色谱 (LC) 分析，样品在制备前将在氮气中储存过夜。 对于气相色谱 (GC) 分析，每个样品在制备前将在真空下干燥过夜。

质量控制。 几种类型的对照实验将与实验样本同时进行。 通过从每个实验样本中提取少量样本生成的合并矩阵样本将作为整个提取数据集中的技术复制。 水等分试样将作为工艺空白。 此外，精心挑选的 QC 标准混合物不会干扰内源性化合物的测量，将被添加到每个分析样品中。 这将允许监测仪器性能并帮助色谱校准。 仪器可变性将通过计算在注入质谱仪 (MS) 之前添加到每个样品中的标准品的中值相对标准偏差 (RSD) 来确定。 整个过程变异性将通过计算 100% 混合基质样品中存在的所有内源性代谢物（即非仪器标准）的中值 RSD 来确定。 实验样品将在整个平台上随机运行，QC 样品每隔 5 或 10 次进样一次，以验证整体分析性能。 内部标准将用于测量仪器的可变性，RSD 中位数为 3%。 此外，总过程可变性将为 8%。

超高效液相色谱-串联质谱法。 所用平台的液相色谱/质谱 (LC/MS) 部分将采用 Waters ACQUITY 超高效液相色谱 (UPLC)、Thermo Scientific Q-Exactive 高分辨率/精确 MS 与加热电喷雾电离（ HESI-II) 源，以及以 35,000 质量分辨率运行的 Orbitrap 质量分析器。 样品提取物将在酸性或碱性 LC 兼容溶剂中干燥和复溶，每种溶剂将包含八个或更多固定浓度的进样 QC 标准品，以确保进样和色谱一致性。 一份将使用酸性、正离子优化条件进行分析，另一份将使用碱性、负离子优化条件在两个独立的注射中使用单独的专用色谱柱（Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm，1.7 m）进行分析。 在酸性条件下重构的提取物将使用含有 0.1% 甲酸的水和甲醇从 C18 柱中梯度洗脱。 来自碱性提取物的第二个等分试样将使用甲醇、水和 6.5 mM 碳酸氢铵从 C18 柱中类似地洗脱。 从亲水相互作用色谱柱（Waters UPLC BEH Amide 2.1 × 150 mm，1.7 m）洗脱后，使用由水和乙腈与 10 mM 甲酸铵组成的梯度，通过负电离分析第三等分试样。

气相色谱-质谱法。 用于 GC-MS 分析的样品将在真空下干燥至少 18 小时，然后在干燥的氮气下用双三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺衍生化。 衍生化样品将在 5% 二苯基/95% 二甲基聚硅氧烷熔融石英柱（20 m × 0.18 mm 内径；0.18 m 膜厚）上分离，以氦气作为载气，温度从 60C 升至 340C，超过 17.5-最小周期。 这些样品将在 Thermo-Finnigan Trace DSQ 快速扫描单四极杆 MS 上使用以单位质量分辨率运行的电子轰击电离 (EI) 进行分析。 扫描范围为 50-750 m/z。

数据提取和化合物鉴定。 将提取原始数据，并对齐和识别峰。 QC 将使用特定的硬件和软件进行处理。 峰将使用曲线下面积 (AUC) 计算进行量化。 将数据与纯化标准品或反复出现的未知实体的库条目进行比较，确定化合物。 生化鉴定将基于三个标准：建议鉴定的窄 RI 窗口内的保留指数 (RI)、与文库的精确质量匹配 ± 0.005 amu 以及实验数据之间的 MS/MS 正向和反向分数和真实的标准。 MS/MS 分数将基于实验质谱中存在的离子与库质谱中存在的离子的比较。 尽管基于这些因素之一，这些分子之间可能存在相似性，但可以利用所有三个数据点来精确区分和区分生化物质。

尿样中 EDCs 暴露的定量。 非持久性 EDC 的分析将通过分散液-液微萃取 (DLLME) 和超高效液相色谱串联质谱检测 (UHPLC-MS/MS) 进行。 简而言之，将尿样在室温下完全解冻，以2600 x g离心10分钟以沉淀颗粒物，并取0.75 mL进行分析。 为了确定 EDC 总量（游离加缀合），每个样品中加入 50 μL 酶溶液（β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶），并在 37 °C 下孵育 24 小时。 将处理过的尿液置于 15 mL 螺旋盖玻璃管中，并加入 30 μL 替代标准溶液（1.25 mg/L BPA-d16）。 用 5% NaCl 水溶液 (w/v) 将尿液稀释至 10.0 mL，并将 pH 值调节至 2.0。 接下来，混合 0.75 mL 丙酮和 0.75 mL 三氯甲烷，并用注射器快速注入水样。 手动摇动、离心和蒸发提取物后，将残留物溶解在 100 μL 由水（0.1% 氨水）/乙腈（0.1% 氨水）70:30 (v/v) 组成的混合物中，最后加入 10 μL注入 LC 系统。 在评估环境化学物质的相同尿样中，使用自动比色法测定尿肌酐浓度。

母体雌激素和雌激素代谢物尿液浓度的定量。 雌酮、雌二醇和 13 种雌激素代谢物的浓度将根据尿肌酐水平 (mg/dl) 进行调整来确定。 将使用三重四极分析仪通过气相色谱串联质谱法评估尿雌激素的定量。 简而言之，使用预先用 4 mL 甲醇和 4 mL 水调节的 C18 SPE 小柱 (Sep-Pack C18) 提取 1 mL 尿液和 25 µL 内标溶液。 加载尿样后，用 4 mL 水清洗小柱。 然后蒸发处理过的尿液。 蒸发后加入 3 mL 醋酸盐缓冲液 0.1 M (pH 4.5) 和 3 µL β-葡萄糖醛酸酶，混合物在 55 °C 下孵育 3 小时。 冷却至室温后，将 pH 值增加至约 9.5。 然后，用 6 mL 叔丁基甲基醚通过振荡和离心提取样品。 最后，将有机层在氮气流下蒸发至干。

其他信息来源和协变量。 将记录参与者的人体测量学、社会人口学和生殖特征。 他们还将授予访问其临床病史的权限。 将记录肿瘤特征和饮食习惯。