Le cancer du sein et sa relation avec le microbiote (MICROMA)

L'étude suivra la Déclaration d'Helsinki et la législation espagnole concernant la recherche clinique. Les données obtenues seront confidentielles et seuls les chercheurs et les participants, sur demande, y auront accès. L'étude suivra également la législation espagnole sur la protection des données afin de garantir la confidentialité, le traitement et la disponibilité des données.

La participation est volontaire. Les participants seront informés de la nature de la recherche et de l'utilisation des échantillons biologiques. En plus des informations verbales, les participants se verront présenter et lire un formulaire de consentement éclairé. L'autorisation a été accordée par le Comité d'éthique d'Andalousie (Espagne).

Critères d'inclusion et d'exclusion. L'âge des femmes se situera entre 25 et 70 ans. Les cas seront des femmes diagnostiquées et opérées d'un cancer du sein incident, stades I et II. Les témoins seront des femmes chirurgicalement intervenues d'augmentation ou de réduction mammaire. Les femmes ayant des antécédents de cancer ou un stade tumoral avancé (métastase), ou ayant reçu un traitement antibiotique 3 mois avant le recrutement, ou tout traitement néoadjuvant, seront exclues de l'étude. Les femmes ayant des antécédents oncologiques, gynécologiques ou endocriniens et celles ayant reçu un traitement antibiotique 3 mois avant le recrutement seront également exclues. Les témoins seront appariés aux cas selon l'âge (± 2 ans), la catégorie d'indice de masse corporelle et l'hôpital de recrutement.

Taille de l'échantillon. Le nombre de cas de cancer du sein comprendra au moins 100 femmes, appariées à 100 femmes témoins. Trois hôpitaux participeront au recrutement : L'Hôpital Universitaire de Jaén, Espagne ; l'Hôpital Universitaire Campus de la Salud de Grenade, Espagne ; et Clinique Ana Moreno (Grenade, Espagne).

Échantillons biologiques. Des échantillons de sang, de tissu mammaire, de selles et d'urine des cas et des témoins seront prélevés. Le sérum sera séparé du sang par centrifugation. Des échantillons de tissu mammaire seront prélevés pendant la chirurgie, à partir d'une zone marginale à 3-5 cm de la tumeur. Pour les contrôles, des échantillons seront prélevés sur tout tissu mammaire disponible pendant la chirurgie de réduction ou d'augmentation mammaire.

Microbiote mammaire et intestinal. Les bactéries, les archées, les champignons et les virus seront étudiés dans des échantillons de fèces et de tissus mammaires. Les échantillons seront prétraités avec des tubes de lyse pathogène L et S (QIAGEN, Barcelone, Espagne). L'ADN sera extrait avec le kit QIAamp cador Pathogen Mini (QIAGEN, Barcelone, Espagne).

Quantification de l'ADN. La concentration d'ADN des échantillons sera évaluée dans un NanoDrop2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Construction et séquençage de bibliothèques métagénomiques. Le kit de préparation de bibliothèque d'ADN Nextera XT (Illumina, San Diego, Californie, États-Unis) sera utilisé pour la construction de la bibliothèque métagénomique. Le mélange de marquage d'amplicon (ATM) dans Nextera XT, qui comprend l'enzyme utilisée pour la tagmentation, sera dilué à 1:10 dans de l'eau sans nucléase pour la construction de la bibliothèque en utilisant 1 à 100 pg d'ADN d'entrée. Chaque 20 μL du mélange réactionnel de tagmentation se compose de 10 μL de tampon TD, 5 μL d'ADN d'entrée et 5 μL d'ATM dilué. Les cycles de PCR pour la construction de la bibliothèque seront de 12, 14, 17 et 20 cycles pour 1 000, 100, 10 et 1 pg d'ADN, respectivement, selon le protocole du fabricant. Le fabricant recommande 12 cycles de réaction PCR pour pas moins de 1 ng d'ADN d'entrée. Les bibliothèques amplifiées seront purifiées à l'aide d'AMPure XP (Agencourt, Brea, CA, USA). La qualité des bibliothèques purifiées sera évaluée à l'aide d'un kit d'ADN haute sensibilité Agilent sur un bioanalyseur Agilent 2100 (Santa Clara, Californie, États-Unis). Les bibliothèques de séquençage seront ensuite quantifiées à l'aide du kit de quantification de bibliothèque KAPA. Les bibliothèques métagénomiques seront mélangées avec PhiX Control v3 (Illumina) dans un rapport de 9:1 et séquencées avec un kit de réactifs Illumina MiSeq v3 (600 cycles). Tous les échantillons à analyser seront combinés dans un pool avant de commencer le séquençage massif. Cette dernière se fera avec l'appareil MiSeq (Illumina).

Traitement des données pour les bibliothèques métagénomiques. Les lectures métagénomiques seront soumises à un écrêtage d'adaptateur et à un ajustement de qualité à l'aide de Trimmomatic v0.3. Les trois premiers nucléotides avec des scores de qualité inférieurs à 20 seront coupés des extrémités de lecture 3' et 5'. Les lectures seront traitées à l'aide d'une méthode de fenêtre glissante, coupant une fois que la qualité moyenne dans la fenêtre (base 4) est tombée en dessous du seuil (Q20). Les lectures d'une longueur inférieure à 100 nucléotides seront alors supprimées. Les lectures de faible complexité seront filtrées à l'aide de PRINSEQ version 0.20.4. Les doublons PCR seront supprimés avec Picard version 2.8.0 (http://broadinstitute.github.io/picard). Les lectures propres et de haute qualité traitées dans chaque bibliothèque seront utilisées dans les analyses ultérieures. Dans l'analyse communautaire basée sur les séquences métagénomiques, les séquences de gènes d'ARNr de petites sous-unités (SSU) seront identifiées à l'aide du logiciel Metaxa2. Les attributions de taxonomie seront effectuées sur la base des résultats d'une recherche BLAST dans la base de données SILVA123, à l'aide du programme MEGAN [23] avec les paramètres suivants : Min Support 1, Min Score 50, Max Expected 1xe-5, Top Percent 10.0. Les compositions des communautés de gènes d'ARNr SSU ont été comparées entre les bibliothèques métagénomiques.

Etude métabolomique. La préparation des échantillons. Les échantillons seront préparés à l'aide du système robotisé MicroLab STARR (Hamilton Company, Salt Lake City, UT, USA). À des fins de contrôle de la qualité (CQ), un standard de récupération sera ajouté à 100 L d'échantillons de sérum avant la première étape du processus d'extraction. Les protéines seront précipitées avec du méthanol en secouant vigoureusement pendant 2 min. Ensuite, les échantillons seront centrifugés pour éliminer les protéines, dissocier les petites molécules liées aux protéines ou piégées dans la matrice protéique précipitée, et récupérer des métabolites chimiquement divers (Glen Mills GenoGrinder 2000, Liban, USA). Ensuite, les échantillons seront placés sur un TurboVapR (Zymark, Californie, USA) pour éliminer le solvant organique. Pour l'analyse par chromatographie liquide (LC), les échantillons seront stockés pendant une nuit dans de l'azote avant préparation. Pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (GC), chaque échantillon sera séché pendant une nuit sous vide avant préparation.

Contrôles qualité. Plusieurs types d'expériences de contrôle seront réalisées en parallèle avec les prélèvements expérimentaux. Un échantillon matriciel regroupé, généré en prélevant un petit volume de chaque échantillon expérimental, servira de réplique technique dans l'ensemble des données extraites. Les aliquotes d'eau serviront de blancs de procédé. De plus, un cocktail d'étalons de CQ soigneusement choisis pour ne pas interférer avec la mesure des composés endogènes sera dopé dans chaque échantillon analysé. Cela permettra de surveiller les performances de l'instrument et d'aider à l'alignement chromatographique. La variabilité de l'instrument sera déterminée en calculant l'écart type relatif médian (RSD) pour les normes qui seront ajoutées à chaque échantillon avant l'injection dans les spectromètres de masse (MS). L'ensemble de la variabilité du processus sera déterminé en calculant le RSD médian pour tous les métabolites endogènes (c'est-à-dire les étalons non instrumentaux) présents dans 100 % des échantillons de matrice regroupés. Les échantillons expérimentaux seront randomisés sur l'ensemble de la plate-forme avec les échantillons QC espacés toutes les 5 ou 10 injections pour vérifier les performances globales du test. Les étalons internes seront utilisés pour mesurer la variabilité de l'instrument et auront un RSD médian de 3 %. De plus, la variabilité totale du procédé sera de 8 %.

Chromatographie liquide ultra-performante-spectrométrie de masse en tandem. La partie chromatographie liquide/spectrométrie de masse (LC/MS) de la plate-forme à utiliser utilisera une chromatographie liquide ultra-performante Waters ACQUITY (UPLC), une MS haute résolution/précise Thermo Scientific Q-Exactive interfacée avec une ionisation par électrospray chauffée ( HESI-II) et un analyseur de masse Orbitrap fonctionnant à une résolution de masse de 35 000. L'extrait d'échantillon sera séché et reconstitué dans des solvants compatibles LC acides ou basiques, chacun contenant au moins huit étalons de CQ injectés à des concentrations fixes pour assurer l'injection et la cohérence chromatographique. Une aliquote sera analysée dans des conditions acides optimisées pour les ions positifs, et une autre sera réalisée dans des conditions basiques optimisées pour les ions négatifs dans deux injections indépendantes utilisant des colonnes dédiées séparées (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 m). Les extraits reconstitués dans des conditions acides seront élues par gradient d'une colonne C18 en utilisant de l'eau et du méthanol contenant 0,1 % d'acide formique. Une deuxième aliquote, à partir de l'extrait basique, sera éluée de la même manière à partir d'une colonne C18 en utilisant du méthanol, de l'eau et du bicarbonate d'ammonium 6,5 mM. Une troisième aliquote sera analysée par ionisation négative après élution d'une colonne de chromatographie à interaction hydrophile (Waters UPLC BEH Amide 2,1 × 150 mm, 1,7 m) en utilisant un gradient constitué d'eau et d'acétonitrile avec 10 mM de formiate d'ammonium.

Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Les échantillons destinés à l'analyse par GC-MS seront séchés sous vide pendant au moins 18 h avant d'être dérivatisés sous azote séché avec du bistriméthylsilyltrifluoroacétamide. Les échantillons dérivés seront séparés sur une colonne de silice fondue 5 % diphényl/95 % diméthyl polysiloxane (20 m × 0,18 mm id ; 0,18 m d'épaisseur de film) avec de l'hélium comme gaz vecteur et une rampe de température de 60 C à 340 C sur une température de 17,5- période min. Les échantillons seront analysés sur un SM quadripolaire à balayage rapide Thermo-Finnigan Trace DSQ utilisant l'ionisation par impact d'électrons (EI) fonctionnant à un pouvoir de résolution de masse unitaire. La plage de balayage sera de 50 à 750 m/z.

Extraction de données et identification de composés. Les données brutes seront extraites, et les pics seront alignés et identifiés. Les CQ seront traités à l'aide de matériel et de logiciels spécifiques. Les pics seront quantifiés à l'aide du calcul de l'aire sous la courbe (AUC). Les composés seront identifiés en comparant les données aux entrées de la bibliothèque d'étalons purifiés ou d'entités inconnues récurrentes. Les identifications biochimiques seront basées sur trois critères : l'indice de rétention (RI) dans une fenêtre RI étroite de l'identification proposée, une correspondance de masse précise avec la bibliothèque ± 0,005 amu, et les scores MS/MS avant et arrière entre les données expérimentales et normes authentiques. Les scores MS/MS seront basés sur une comparaison des ions présents dans le spectre expérimental avec les ions présents dans le spectre de la bibliothèque. Bien qu'il puisse y avoir des similitudes entre ces molécules sur la base de l'un de ces facteurs, l'utilisation des trois points de données peut être utilisée pour distinguer et différencier les produits biochimiques avec précision.

Quantification de l'exposition aux perturbateurs endocriniens dans les échantillons d'urine. L'analyse des perturbateurs endocriniens non persistants sera réalisée par microextraction liquide-liquide dispersive (DLLME) et chromatographie liquide à ultra haute performance avec détection par spectrométrie de masse en tandem (UHPLC-MS/MS). En bref, les échantillons d'urine sont complètement décongelés à température ambiante, centrifugés à 2600 x g pendant 10 min pour sédimenter les particules et 0,75 ml sont prélevés pour effectuer l'analyse. Afin de déterminer la quantité totale d'EDC (libres et conjugués), chaque échantillon est additionné de 50 μL de solution enzymatique (β-glucuronidase/sulfatase) et incubé à 37 °C pendant 24 h. L'urine traitée est placée dans un tube en verre à bouchon à vis de 15 ml et additionnée de 30 μl de la solution standard de substitution (1,25 mg/l de BPA-d16). L'urine est diluée à 10,0 ml avec une solution aqueuse de NaCl à 5 ​​% (p/v) et le pH est ajusté à 2,0. Ensuite, 0,75 mL d'acétone et 0,75 mL de trichlorométhane sont mélangés et injectés rapidement dans l'échantillon aqueux avec une seringue. Après agitation manuelle, centrifugation et évaporation de l'extrait, le culot est solubilisé avec 100 μL d'un mélange eau (0,1% ammoniaque)/acétonitrile (0,1% ammoniaque), 70:30 (v/v), et enfin 10 μL est injecté dans le système LC. La concentration de créatinine urinaire est déterminée à l'aide d'une détermination colorimétrique automatisée dans les mêmes échantillons d'urine dans lesquels la substance chimique environnementale est évaluée.

Quantification des concentrations urinaires des œstrogènes parents et des métabolites des œstrogènes. Les concentrations d'œstrone, d'œstradiol et de 13 métabolites d'œstrogène seront déterminées en ajustant les taux de créatinine urinaire (mg/dl). La quantification des œstrogènes urinaires sera évaluée par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse en tandem à l'aide d'un analyseur triple quadripôle. En bref, un mL d'urine avec 25 µL de solution d'étalon interne est extrait à l'aide de la cartouche SPE C18 (Sep-Pack C18) préalablement conditionnée avec 4 mL de méthanol et 4 mL d'eau. Après chargement de l'échantillon d'urine, la cartouche est lavée avec 4 mL d'eau. L'urine traitée est ensuite évaporée. Trois mL de tampon acétate 0,1 M (pH 4,5) et 3 µL de β-glucuronidase sont ajoutés à l'évaporé, et le mélange est incubé pendant 3 h à 55 °C. Après refroidissement à température ambiante, le pH a été porté à environ 9,5. Ensuite, les échantillons sont extraits avec 6 ml de tert-butyl méthyl éther par agitation et centrifugés. Enfin, la couche organique est évaporée à sec sous courant d'azote.

Autres sources d'information et covariables. Les caractéristiques anthropométriques, sociodémographiques et reproductives des participants seront enregistrées. Ils accorderont également la permission d'accéder à leurs antécédents cliniques. Les caractéristiques tumorales et les habitudes alimentaires seront enregistrées.