Il cancro al seno e la sua relazione con il microbiota (MICROMA)

Lo studio seguirà la Dichiarazione di Helsinki e la legislazione spagnola in materia di ricerca clinica. I dati ottenuti saranno riservati e solo i ricercatori ei partecipanti, su richiesta, avranno accesso ad essi. Lo studio seguirà anche la legislazione sulla protezione dei dati della Spagna per garantire la riservatezza, il trattamento e la disponibilità dei dati.

La partecipazione è volontaria. I partecipanti saranno informati sulla natura della ricerca e sull'utilizzo di campioni biologici. Oltre alle informazioni verbali, ai partecipanti verrà presentato e letto un consenso informato. L'autorizzazione è stata concessa dal Comitato Etico dell'Andalusia (Spagna).

Criteri di inclusione e di esclusione. L'età delle donne va dai 25 ai 70 anni. I casi saranno donne con diagnosi e interventi chirurgici di carcinoma mammario incidente, stadi I e II. I controlli saranno donne chirurgicamente intervenute di mastoplastica additiva o riduttiva. Saranno escluse dallo studio le donne con antecedenti di cancro o stadio tumorale avanzato (metastasi), o che hanno ricevuto un trattamento antibiotico 3 mesi prima dell'arruolamento o qualsiasi terapia neoadiuvante. Saranno escluse anche le donne con antecedenti oncologici, ginecologici o endocrini e quelle che hanno ricevuto un trattamento antibiotico 3 mesi prima dell'assunzione. I controlli saranno abbinati ai casi per età (± 2 anni), categoria di indice di massa corporea e ospedale di reclutamento.

Misura di prova. Il numero di casi di cancro al seno includerà almeno 100 donne, abbinate a 100 donne di controllo. Tre ospedali parteciperanno al reclutamento: L'ospedale universitario di Jaén, Spagna; l'Ospedale Universitario Campus de la Salud di Granada, Spagna; e Clinica Ana Moreno (Granada, Spagna).

Campioni biologici. Saranno raccolti campioni di sangue, tessuto mammario, feci e urine da casi e controlli. Il siero sarà separato dal sangue mediante centrifugazione. I campioni di tessuto mammario verranno prelevati durante l'intervento chirurgico, da un'area marginale a 3-5 cm di distanza dal tumore. Per i controlli, i campioni verranno prelevati da qualsiasi tessuto mammario disponibile durante l'intervento chirurgico di riduzione o aumento del seno.

Microbiota mammario e intestinale. Batteri, archaea, funghi e virus saranno studiati nelle feci e nei campioni di tessuto mammario. I campioni saranno pretrattati con provette per lisi dei patogeni L e S (QIAGEN, Barcellona, ​​Spagna). Il DNA sarà estratto con il kit QIAamp cador Pathogen Mini (QIAGEN, Barcellona, ​​Spagna).

Quantificazione del DNA. La concentrazione di DNA dei campioni sarà valutata in un NanoDrop2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Costruzione e sequenziamento di librerie metagenomiche. Il Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) verrà utilizzato per la costruzione di librerie metagenomiche. L'amplicone tagment mix (ATM) in Nextera XT, che include l'enzima utilizzato per la tagmentazione, sarà diluito 1:10 in acqua priva di nucleasi per la costruzione della libreria utilizzando da 1 a 100 pg di DNA di input. Ogni 20 μL della miscela di reazione di tagmentazione è costituito da 10 μL di tampone TD, 5 μL di DNA di input e 5 μL di ATM diluito. I cicli di PCR per la costruzione della libreria saranno rispettivamente di 12, 14, 17 e 20 cicli per 1.000, 100, 10 e 1 pg di DNA, seguendo il protocollo del produttore. Il produttore raccomanda 12 cicli della reazione PCR per non meno di 1 ng di DNA in ingresso. Le librerie amplificate saranno purificate utilizzando AMPure XP (Agencourt, Brea, CA, USA). La qualità delle librerie purificate sarà valutata utilizzando un Agilent High Sensitivity DNA Kit su un Agilent 2100 Bioanalyzer (Santa Clara, CA, USA). Le librerie di sequenziamento saranno ulteriormente quantificate utilizzando il kit di quantificazione della libreria KAPA. Le librerie metagenomiche saranno miscelate con PhiX Control v3 (Illumina) in un rapporto di 9:1 e sequenziate con un Illumina MiSeq Reagent Kit v3 (600 cicli). Tutti i campioni da analizzare saranno combinati in un pool prima di iniziare il sequenziamento massivo. Quest'ultimo sarà fatto con l'apparato MiSeq (Illumina).

Elaborazione dati per librerie metagenomiche. Le letture metagenomiche saranno sottoposte a ritaglio dell'adattatore e trimming di qualità utilizzando Trimmomatic v0.3. I primi tre nucleotidi con punteggi di qualità inferiori a 20 saranno tagliati dalle estremità di lettura 3' e 5'. Le letture verranno elaborate utilizzando un metodo a finestra scorrevole, tagliando una volta che la qualità media all'interno della finestra (base 4) è scesa al di sotto della soglia (Q20). Le letture con una lunghezza inferiore a 100 nucleotidi verranno quindi rimosse. Le letture a bassa complessità verranno filtrate utilizzando PRINSEQ versione 0.20.4. I duplicati PCR verranno rimossi con Picard versione 2.8.0 (http://broadinstitute.github.io/picard). Le letture pulite e di alta qualità elaborate in ciascuna libreria verranno utilizzate nelle analisi successive. Nell'analisi di comunità basata sulle sequenze metagenomiche, le sequenze geniche dell'rRNA delle piccole subunità (SSU) saranno identificate utilizzando il software Metaxa2. Le assegnazioni della tassonomia saranno eseguite sulla base dei risultati di una ricerca BLAST rispetto al database SILVA123, utilizzando il programma MEGAN [23] con le seguenti impostazioni: Min Support 1, Min Score 50, Max Expected 1xe-5, Top Percent 10.0. Le composizioni della comunità del gene SSU rRNA sono state confrontate tra le librerie metagenomiche.

Studio metabolomico. Preparazione del campione. I campioni saranno preparati utilizzando il sistema robotizzato MicroLab STARR (Hamilton Company, Salt Lake City, UT, USA). Ai fini del controllo di qualità (QC), uno standard di recupero verrà aggiunto a 100 L di campioni di siero prima della prima fase del processo di estrazione. Le proteine ​​saranno precipitate con metanolo agitando vigorosamente per 2 min. Successivamente, i campioni saranno centrifugati per rimuovere le proteine, dissociare le piccole molecole legate alle proteine ​​o intrappolate nella matrice proteica precipitata, e per recuperare metaboliti chimicamente diversi (Glen Mills GenoGrinder 2000, Libano, USA). Quindi, i campioni verranno posizionati su un TurboVapR (Zymark, California, USA) per rimuovere il solvente organico. Per l'analisi mediante cromatografia liquida (LC), i campioni saranno conservati per una notte in azoto prima della preparazione. Per l'analisi gascromatografica (GC), ogni campione verrà essiccato per una notte sotto vuoto prima della preparazione.

Controlli di qualità. Diversi tipi di esperimenti di controllo saranno eseguiti in parallelo con i campioni sperimentali. Un campione di matrice raggruppato, generato prelevando un piccolo volume di ciascun campione sperimentale, fungerà da replica tecnica in tutto il set di dati estratti. Le aliquote d'acqua serviranno come grezzi di processo. Inoltre, in ogni campione analizzato verrà aggiunto un cocktail di standard QC accuratamente scelti per non interferire con la misurazione dei composti endogeni. Ciò consentirà il monitoraggio delle prestazioni dello strumento e l'assistenza nell'allineamento cromatografico. La variabilità dello strumento sarà determinata calcolando la deviazione standard relativa mediana (RSD) per gli standard che verranno aggiunti a ciascun campione prima dell'iniezione negli spettrometri di massa (MS). L'intera variabilità del processo sarà determinata calcolando l'RSD mediano per tutti i metaboliti endogeni (cioè standard non strumentali) presenti nel 100% dei campioni di matrice raggruppati. I campioni sperimentali saranno randomizzati attraverso la piattaforma eseguita con i campioni QC distanziati ogni 5 o 10 iniezioni per verificare le prestazioni complessive del test. Gli standard interni saranno utilizzati per misurare la variabilità dello strumento e avranno un RSD mediano del 3%. Inoltre, la variabilità totale del processo sarà dell'8%.

Spettrometria di massa tandem cromatografia liquida ultra performante. La porzione di cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) della piattaforma da utilizzare impiegherà una cromatografia liquida ultra performante Waters ACQUITY (UPLC), una MS Thermo Scientific Q-Exactive ad alta risoluzione/precisa interfacciata con una ionizzazione elettrospray riscaldata ( HESI-II) e un analizzatore di massa Orbitrap operante con una risoluzione di 35.000 masse. L'estratto del campione sarà essiccato e ricostituito in solventi acidi o basici compatibili con LC, ciascuno dei quali conterrà otto o più standard QC iniettati a concentrazioni fisse per garantire l'iniezione e la coerenza cromatografica. Un'aliquota verrà analizzata utilizzando condizioni acide ottimizzate per ioni positivi e un'altra verrà eseguita utilizzando condizioni basiche ottimizzate per ioni negativi in ​​due iniezioni indipendenti utilizzando colonne dedicate separate (Waters UPLC BEH C18-2,1 × 100 mm, 1,7 m). Gli estratti ricostituiti in condizioni acide saranno eluiti in gradiente da una colonna C18 utilizzando acqua e metanolo contenente acido formico allo 0.1%. Una seconda aliquota, dall'estratto basico, sarà similmente eluita da una colonna C18 usando metanolo, acqua e bicarbonato di ammonio 6.5 mM. Una terza aliquota sarà analizzata mediante ionizzazione negativa dopo l'eluizione da una colonna cromatografica di interazione idrofila (Waters UPLC BEH Amide 2.1 × 150 mm, 1.7 m) utilizzando un gradiente costituito da acqua e acetonitrile con formiato di ammonio 10 mM.

Gascromatografia-spettrometria di massa. I campioni destinati all'analisi mediante GC-MS saranno essiccati sotto vuoto per un minimo di 18 ore prima di essere derivatizzati sotto azoto essiccato con bistrimetilsililtrifluoroacetammide. I campioni derivatizzati saranno separati su una colonna di silice fusa al 5% difenil/95% dimetil polisilossano (20 m × 0,18 mm d.i.; 0,18 m di spessore del film) con elio come gas di trasporto e una rampa di temperatura da 60°C a 340°C su un periodo di 17,5- periodo min. I campioni saranno analizzati su un MS a singolo quadrupolo a scansione rapida Thermo-Finnigan Trace DSQ utilizzando la ionizzazione per impatto elettronico (EI) operata a potere di risoluzione di massa unitario. L'intervallo di scansione sarà 50-750 m/z.

Estrazione dei dati e identificazione dei composti. I dati grezzi verranno estratti e i picchi verranno allineati e identificati. I QC verranno elaborati utilizzando hardware e software specifici. I picchi saranno quantificati utilizzando il calcolo dell'area sotto la curva (AUC). I composti saranno identificati confrontando i dati con voci di libreria di standard purificati o entità sconosciute ricorrenti. Le identificazioni biochimiche si baseranno su tre criteri: l'indice di ritenzione (RI) all'interno di una finestra RI ristretta dell'identificazione proposta, un'accurata corrispondenza di massa con la libreria ± 0,005 amu e i punteggi MS/MS avanti e indietro tra i dati sperimentali e standard autentici. I punteggi MS/MS saranno basati su un confronto degli ioni presenti nello spettro sperimentale con gli ioni presenti nello spettro della libreria. Sebbene possano esserci somiglianze tra queste molecole basate su uno di questi fattori, l'uso di tutti e tre i punti dati può essere utilizzato per distinguere e differenziare con precisione le sostanze biochimiche.

Quantificazione dell'esposizione agli EDC nei campioni di urina. L'analisi degli EDC non persistenti sarà effettuata mediante microestrazione liquido-liquido dispersiva (DLLME) e cromatografia liquida ad altissime prestazioni con rivelazione mediante spettrometria di massa tandem (UHPLC-MS/MS). In breve, i campioni di urina vengono scongelati completamente a temperatura ambiente, centrifugati a 2600 x g per 10 minuti per sedimentare il particolato e prelevati 0,75 mL per eseguire l'analisi. Per determinare la quantità totale di EDC (liberi più coniugati), ogni campione viene arricchito con 50 μL di soluzione enzimatica (β-glucuronidasi/solfatasi) e incubato a 37 °C per 24 ore. L'urina trattata viene posta in una provetta di vetro con tappo a vite da 15 mL e addizionata con 30 μL della soluzione standard surrogata (1,25 mg/L di BPA-d16). L'urina viene diluita a 10,0 mL con una soluzione acquosa di NaCl al 5% (p/v) e il pH viene regolato a 2,0. Successivamente, 0,75 mL di acetone e 0,75 mL di triclorometano vengono miscelati e iniettati rapidamente nel campione acquoso con una siringa. Dopo agitazione manuale, centrifugazione ed evaporazione dell'estratto, il residuo viene sciolto con 100 μL di una miscela costituita da acqua (0,1% ammoniaca)/acetonitrile (0,1% ammoniaca), 70:30 (v/v), e infine 10 μL viene iniettato nel sistema LC. La concentrazione di creatinina urinaria viene determinata utilizzando una determinazione colorimetrica automatizzata negli stessi campioni di urina in cui viene valutata la sostanza chimica ambientale.

Quantificazione delle concentrazioni urinarie degli estrogeni progenitori e dei metaboliti degli estrogeni. Le concentrazioni di estrone, estradiolo e 13 metaboliti degli estrogeni saranno determinate aggiustando per i livelli di creatinina urinaria (mg/dl). La quantificazione degli estrogeni urinari sarà valutata mediante spettrometria di massa tandem gascromatografica utilizzando un analizzatore a triplo quadrupolo. In breve, un mL di urina con 25 µL di soluzione di standard interni viene estratto utilizzando la cartuccia C18 SPE (Sep-Pack C18) precedentemente condizionata con 4 mL di metanolo e 4 mL di acqua. Dopo aver caricato il campione di urina, la cartuccia viene lavata con 4 mL di acqua. L'urina trattata viene quindi evaporata. Tre mL di tampone acetato 0,1 M (pH 4,5) e 3 µL di β-glucuronidasi vengono aggiunti all'evaporato e la miscela viene incubata per 3 h a 55 °C. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, il pH è stato aumentato a circa 9,5. Quindi, i campioni vengono estratti con 6 mL di terz-butil metil etere mediante agitazione e centrifugati. Infine lo strato organico viene evaporato a secchezza sotto flusso di azoto.

Altre fonti di informazione e covariabili. Verranno registrate le caratteristiche antropometriche, sociodemografiche e riproduttive dei partecipanti. Concederanno inoltre il permesso di accedere alla loro storia clinica. Verranno registrate le caratteristiche del tumore e le abitudini alimentari.