Рак молочной железы и его связь с микробиотой (MICROMA)

Исследование будет проводиться в соответствии с Хельсинкской декларацией и испанским законодательством в отношении клинических исследований. Полученные данные будут конфиденциальными, и доступ к ним будут иметь только исследователи и участники по запросу. Исследование также будет соответствовать законодательству Испании о защите данных, чтобы гарантировать конфиденциальность, обработку и доступность данных.

Участие добровольное. Участники будут проинформированы о характере исследования и использовании биологических образцов. В дополнение к устной информации участникам будет представлено и зачитано информированное согласие. Разрешение было предоставлено Комитетом по этике Андалусии (Испания).

Критерии включения и исключения. Возраст женщин будет колебаться в пределах 25-70 лет. Случаи будут у женщин с диагнозом и хирургическим вмешательством по поводу возникшего рака молочной железы I и II стадий. Контролем будут женщины, которым хирургическим путем увеличили или уменьшили грудь. Женщины с раком в анамнезе или поздней стадией опухоли (метастазами), или получавшие лечение антибиотиками за 3 месяца до набора, или любую неоадъювантную терапию, будут исключены из исследования. Женщины с онкологическими, гинекологическими или эндокринными заболеваниями, а также те, кто получал лечение антибиотиками за 3 месяца до набора, также будут исключены. Контрольная группа будет соответствовать случаям по возрасту (± 2 года), категории индекса массы тела и стационару набора.

Размер образца. Число случаев рака молочной железы будет включать не менее 100 женщин, соответствующих 100 контрольным женщинам. В наборе примут участие три больницы: Университетская больница Хаэна, Испания; Университетская больница Кампус-де-ла-Салуд в Гранаде, Испания; и клиника Ана Морено (Гранада, Испания).

Биологические образцы. Будут собраны образцы крови, ткани молочной железы, стула и мочи у пациентов и контрольной группы. Сыворотку отделяют от крови центрифугированием. Образцы ткани молочной железы будут взяты во время операции с краевой области на расстоянии 3-5 см от опухоли. Для контроля образцы будут взяты из любой доступной ткани молочной железы во время операции по уменьшению или увеличению груди.

Микробиота молочной железы и кишечника. Бактерии, археи, грибки и вирусы будут исследованы в образцах фекалий и тканей молочной железы. Образцы будут предварительно обработаны пробирками для лизиса патогенов L и S (QIAGEN, Барселона, Испания). ДНК будет извлечена с помощью набора QIAamp cador Pathogen Mini (QIAGEN, Барселона, Испания).

Количественное определение ДНК. Концентрация ДНК в образцах будет оцениваться в NanoDrop2000c (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

Создание и секвенирование метагеномной библиотеки. Комплект для подготовки ДНК-библиотеки Nextera XT (Иллюмина, Сан-Диего, Калифорния, США) будет использоваться для создания метагеномной библиотеки. Смесь меток ампликона (ATM) в Nextera XT, которая включает фермент, используемый для маркировки, будет разбавлена ​​1:10 в воде, не содержащей нуклеаз, для создания библиотеки с использованием исходной ДНК от 1 до 100 пг. Каждые 20 мкл реакционной смеси мечения состоят из 10 мкл буфера TD, 5 мкл входной ДНК и 5 мкл разбавленного АТМ. Циклы ПЦР для построения библиотеки будут составлять 12, 14, 17 и 20 циклов для 1000, 100, 10 и 1 пг ДНК соответственно в соответствии с протоколом производителя. Производитель рекомендует 12 циклов ПЦР для не менее 1 нг вводимой ДНК. Амплифицированные библиотеки очищают с использованием AMPure XP (Agencourt, Бреа, Калифорния, США). Качество очищенных библиотек будет оцениваться с использованием набора Agilent High Sensitivity DNA Kit на биоанализаторе Agilent 2100 (Санта-Клара, Калифорния, США). Библиотеки секвенирования будут дополнительно количественно оценены с использованием набора KAPA Library Quantification Kit. Метагеномные библиотеки будут смешаны с PhiX Control v3 (Illumina) в соотношении 9:1 и секвенированы с помощью набора реагентов Illumina MiSeq Reagent Kit v3 (600 циклов). Все образцы для анализа будут объединены в пул перед началом массового секвенирования. Последнее будет выполнено с помощью аппарата MiSeq (Illumina).

Обработка данных для метагеномных библиотек. Метагеномные считывания будут подвергнуты обрезке адаптера и обрезке по качеству с использованием Trimmomatic v0.3. Первые три нуклеотида с показателями качества менее 20 будут вырезаны из 3'- и 5'-концов считывания. Чтения будут обрабатываться с использованием метода скользящего окна, сокращающегося, как только среднее качество в пределах окна (4 базы) упадет ниже порогового значения (Q20). Затем считывания длиной менее 100 нуклеотидов будут удалены. Чтения низкой сложности будут отфильтрованы с помощью PRINSEQ версии 0.20.4. Дубликаты PCR будут удалены с помощью Picard версии 2.8.0 (http://broadinstitute.github.io/picard). Обработанные высококачественные и чистые чтения в каждой библиотеке будут использоваться в последующих анализах. В анализе сообщества, основанном на метагеномных последовательностях, последовательности генов рРНК малых субъединиц (SSU) будут идентифицированы с использованием программного обеспечения Metaxa2. Назначения таксономии будут выполняться на основе результатов поиска BLAST по базе данных SILVA123 с использованием программы MEGAN [23] со следующими настройками: Минимальная поддержка 1, Минимальная оценка 50, Максимальное ожидаемое значение 1xe-5, Верхний процент 10,0. Составы сообщества генов SSU рРНК сравнивались среди метагеномных библиотек.

Метаболомическое исследование. Базовые приготовления. Образцы будут подготовлены с использованием автоматизированной роботизированной системы MicroLab STARR (Hamilton Company, Солт-Лейк-Сити, Юта, США). В целях контроля качества (КК) стандарт восстановления будет добавлен к 100 л образцов сыворотки перед первым этапом процесса экстракции. Белки осаждают метанолом при энергичном встряхивании в течение 2 мин. Затем образцы будут центрифугированы для удаления белков, диссоциации небольших молекул, связанных с белками или захваченных в осажденной белковой матрице, и для извлечения химически разнообразных метаболитов (Glen Mills GenoGrinder 2000, Ливан, США). Затем образцы будут помещены в TurboVapR (Zymark, Калифорния, США) для удаления органического растворителя. Для анализа с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ) образцы будут храниться в течение ночи в азоте перед подготовкой. Для газовой хроматографии (ГХ) каждый образец будет высушен в течение ночи в вакууме перед подготовкой.

Контроль качества. Параллельно с экспериментальными образцами будет проведено несколько типов контрольных экспериментов. Объединенная матричная выборка, созданная путем взятия небольшого объема каждой экспериментальной выборки, будет служить технической репликой всего извлеченного набора данных. Аликвоты воды будут служить в качестве холостых проб. Кроме того, в каждую анализируемую пробу будет добавлена ​​смесь стандартов контроля качества, тщательно подобранных, чтобы не мешать измерению эндогенных соединений. Это позволит контролировать работу прибора и поможет в хроматографической настройке. Изменчивость прибора будет определяться путем расчета среднего относительного стандартного отклонения (RSD) для стандартов, которые будут добавляться к каждому образцу перед вводом в масс-спектрометры (МС). Полная изменчивость процесса будет определяться путем расчета медианы RSD для всех эндогенных метаболитов (т. е. неинструментальных стандартов), присутствующих в 100% объединенных образцов матрицы. Экспериментальные образцы будут рандомизированы на платформе с образцами для контроля качества, расположенными через каждые 5 или 10 инъекций, чтобы проверить общую эффективность анализа. Внутренние стандарты будут использоваться для измерения изменчивости прибора и будут иметь медианное относительное стандартное отклонение 3%. Кроме того, общая изменчивость процесса составит 8%.

Сверхэффективная жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия. Часть платформы, предназначенная для жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС), будет использовать сверхэффективную жидкостную хроматографию (UPLC) Waters ACQUITY, МС высокого разрешения/точности Thermo Scientific Q-Exactive, сопряженную с ионизацией нагретым электрораспылением ( источник HESI-II) и масс-анализатор Orbitrap, работающий с разрешением 35 000 масс. Экстракт пробы будет высушен и восстановлен в кислых или основных растворителях, совместимых с ЖХ, каждый из которых будет содержать восемь или более введенных стандартов контроля качества в фиксированных концентрациях для обеспечения согласованности ввода и хроматографии. Одна аликвота будет проанализирована с использованием кислых условий, оптимизированных для положительных ионов, а другая будет выполнена с использованием основных условий, оптимизированных для отрицательных ионов, в два независимых ввода с использованием отдельных специальных колонок (Waters UPLC BEH C18-2,1 × 100 мм, 1,7 м). Экстракты, восстановленные в кислых условиях, будут элюированы градиентным элюированием из колонки C18 с использованием воды и метанола, содержащего 0,1% муравьиной кислоты. Вторую аликвоту из основного экстракта аналогичным образом элюируют из колонки C18 с использованием метанола, воды и 6,5 мМ бикарбоната аммония. Третью аликвоту анализируют с помощью отрицательной ионизации после элюирования с колонки для хроматографии гидрофильного взаимодействия (Waters UPLC BEH Amide 2,1 × 150 мм, 1,7 м) с использованием градиента, состоящего из воды и ацетонитрила с 10 мМ формиата аммония.

Газовая хроматография-масс-спектрометрия. Образцы, предназначенные для анализа с помощью ГХ-МС, будут высушены в вакууме в течение как минимум 18 часов, а затем подвергнуты дериватизации в атмосфере осушенного азота с помощью бистриметилсилилтрифторацетамида. Производные образцы будут разделены на колонке из плавленого кварца 5% дифенил/95% диметилполисилоксан (20 м × внутренний диаметр 0,18 мм; толщина пленки 0,18 м) с гелием в качестве газа-носителя и линейным изменением температуры от 60°С до 340°С в течение 17,5-17,5°С. мин период. Образцы будут проанализированы на быстросканирующем моноквадрупольном МС Thermo-Finnigan Trace DSQ с использованием ионизации электронным ударом (ЭУ) с разрешающей способностью единицы массы. Диапазон сканирования составит 50-750 м/з.

Извлечение данных и идентификация соединений. Необработанные данные будут извлечены, а пики будут выровнены и идентифицированы. QC будут обрабатываться с использованием специального оборудования и программного обеспечения. Пики будут количественно определены с использованием расчета площади под кривой (AUC). Соединения будут идентифицированы путем сравнения данных с библиотечными записями очищенных стандартов или повторяющихся неизвестных объектов. Биохимическая идентификация будет основываться на трех критериях: индекс удерживания (RI) в пределах узкого окна RI предлагаемой идентификации, точное соответствие массы библиотеке ± 0,005 а.е.м. и прямые и обратные оценки МС/МС между экспериментальными данными. и аутентичные стандарты. Баллы MS/MS будут основаны на сравнении ионов, присутствующих в экспериментальном спектре, с ионами, присутствующими в спектре библиотеки. Хотя между этими молекулами может быть сходство на основе одного из этих факторов, использование всех трех точек данных может быть использовано для точного различения и дифференциации биохимических веществ.

Количественная оценка воздействия EDC в образцах мочи. Анализ нестойких EDC будет проводиться методом дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции (DLLME) и сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (UHPLC-MS/MS). Вкратце, образцы мочи полностью оттаивают при комнатной температуре, центрифугируют при 2600 g в течение 10 минут для осаждения твердых частиц и берут 0,75 мл для проведения анализа. Для определения общего количества EDC (свободных и конъюгированных) в каждый образец добавляли 50 мкл раствора фермента (β-глюкуронидаза/сульфатаза) и инкубировали при 37 °C в течение 24 часов. Обработанную мочу помещают в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл и добавляют 30 мкл раствора суррогатного стандарта (1,25 мг/л BPA-d16). Мочу разбавляют до 10,0 мл 5% водным раствором NaCl (масса/объем) и доводят рН до 2,0. Затем смешивают 0,75 мл ацетона и 0,75 мл трихлорметана и быстро вводят шприцем в водный образец. После ручного встряхивания, центрифугирования и выпаривания экстракта остаток растворяют в 100 мкл смеси, состоящей из воды (0,1% аммиака)/ацетонитрила (0,1% аммиака), 70:30 (об./об.), и, наконец, 10 мкл. вводится в систему LC. Концентрация креатинина в моче определяется с помощью автоматического колориметрического определения в тех же образцах мочи, в которых оценивается химическое вещество окружающей среды.

Количественное определение концентрации исходных эстрогенов и метаболитов эстрогенов в моче. Концентрации эстрона, эстрадиола и 13 метаболитов эстрогена будут определяться с поправкой на уровень креатинина в моче (мг/дл). Количественное определение эстрогенов в моче будет оцениваться с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией с использованием тройного квадрупольного анализатора. Вкратце, один мл мочи с 25 мкл раствора внутренних стандартов экстрагируют с использованием картриджа для ТФЭ C18 (Sep-Pack C18), предварительно кондиционированного 4 мл метанола и 4 мл воды. После загрузки образца мочи картридж промывают 4 мл воды. Затем обработанную мочу выпаривают. К выпаренной смеси добавляют 3 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,5) и 3 мкл β-глюкуронидазы, смесь инкубируют 3 ч при 55 °С. После охлаждения до комнатной температуры рН повышали приблизительно до 9,5. Затем образцы экстрагируют 6 мл трет-бутилметилового эфира при встряхивании и центрифугируют. Наконец, органический слой выпаривают досуха в токе азота.

Другие источники информации и сопутствующие переменные. Будут зарегистрированы антропометрические, социально-демографические и репродуктивные особенности участников. Они также дадут разрешение на доступ к своей истории болезни. Будут записаны особенности опухоли и диетические привычки.