Rakovina prsu a její vztah s mikrobiotou (MICROMA)

Studie se bude řídit Helsinskou deklarací a španělskou legislativou týkající se klinického výzkumu. Získaná data budou důvěrná a na požádání k nim budou mít přístup pouze výzkumní pracovníci a účastníci. Studie se bude také řídit španělskou legislativou na ochranu údajů, aby byla zaručena důvěrnost údajů, zpracování a dostupnost.

Účast je dobrovolná. Účastníci budou informováni o povaze výzkumu a využití biologických vzorků. Kromě verbálních informací bude účastníkům předložen a přečten informovaný souhlas. Povolení udělila Etická komise Andalusie (Španělsko).

Kritéria zařazení a vyloučení. Věk žen se bude pohybovat v rozmezí 25-70 let. Půjde o ženy s diagnózou a chirurgicky intervenovanou rakovinou prsu, stadia I a II. Kontroly budou ženy chirurgicky intervenované zvětšením nebo zmenšením prsou. Ženy s předchůdci rakoviny nebo pokročilého stadia nádoru (metastázy), nebo které podstoupily antibiotickou léčbu 3 měsíce před náborem nebo jakoukoli neoadjuvantní terapii, budou ze studie vyloučeny. Vyloučeny budou také ženy s onkologickými, gynekologickými nebo endokrinními předchůdci a ženy, které byly 3 měsíce před náborem léčeny antibiotiky. Kontroly budou přiřazeny k případům podle věku (± 2 roky), kategorie indexu tělesné hmotnosti a nemocnice, v níž byl přijat.

Velikost vzorku. Počet případů rakoviny prsu bude zahrnovat alespoň 100 žen, což odpovídá 100 kontrolním ženám. Náboru se zúčastní tři nemocnice: Univerzitní nemocnice v Jaén, Španělsko; univerzitní nemocnice Campus de la Salud v Granadě, Španělsko; a Ana Moreno Clinic (Granada, Španělsko).

Biologické vzorky. Budou odebrány vzorky krve, prsní tkáně, stolice a moči z případů a kontrol. Sérum bude odděleno od krve centrifugací. Vzorky prsní tkáně budou odebrány během operace, z okrajové oblasti vzdálené 3-5 cm od nádoru. U kontrol budou odebrány vzorky z jakékoli dostupné prsní tkáně během operace zmenšení nebo zvětšení prsou.

Prsní a střevní mikrobiota. Bakterie, archaea, houby a viry budou zkoumány ve vzorcích stolice a prsní tkáně. Vzorky budou předem ošetřeny zkumavkami L a S pro lýzu patogenů (QIAGEN, Barcelona, ​​Španělsko). DNA bude extrahována pomocí sady QIAamp cador Pathogen Mini (QIAGEN, Barcelona, ​​Španělsko).

kvantifikace DNA. Koncentrace DNA ve vzorcích bude vyhodnocena v NanoDrop2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Konstrukce a sekvenování metagenomické knihovny. Pro konstrukci metagenomické knihovny bude použita sada Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA, USA). Amplikonová tagmentová směs (ATM) v Nextera XT, která obsahuje enzym použitý pro značení, bude zředěna v poměru 1:10 ve vodě bez nukleázy pro konstrukci knihovny s použitím 1 až 100 pg vstupní DNA. Každých 20 μl značkovací reakční směsi se skládá z 10 μl TD pufru, 5 μl vstupní DNA a 5 μl naředěného ATM. Cykly PCR pro konstrukci knihovny budou 12, 14, 17 a 20 cyklů pro 1000, 100, 10 a 1 pg DNA, v daném pořadí, podle protokolu výrobce. Výrobce doporučuje 12 cyklů PCR reakce pro ne méně než 1 ng vstupní DNA. Amplifikované knihovny budou purifikovány pomocí AMPure XP (Agencourt, Brea, CA, USA). Kvalita purifikovaných knihoven bude hodnocena pomocí soupravy Agilent High Sensitivity DNA Kit na bioanalyzátoru Agilent 2100 (Santa Clara, CA, USA). Sekvenační knihovny budou dále kvantifikovány pomocí KAPA Library Quantification Kit. Metagenomické knihovny budou smíchány s PhiX Control v3 (Illumina) v poměru 9:1 a sekvenovány pomocí Illumina MiSeq Reagent Kit v3 (600 cyklů). Všechny vzorky, které mají být analyzovány, budou spojeny do poolu před zahájením masivního sekvenování. To bude provedeno pomocí přístroje MiSeq (Illumina).

Zpracování dat pro metagenomické knihovny. Metagenomické čtení bude podrobeno oříznutí adaptéru a kvalitnímu oříznutí pomocí Trimmomatic v0.3. První tři nukleotidy se skóre kvality menším než 20 budou vyříznuty z čtených konců 3' a 5'. Čtení budou zpracována metodou posuvného okna, která se ořízne, jakmile průměrná kvalita v rámci okna (4 báze) klesne pod prahovou hodnotu (Q20). Čtení s délkou menší než 100 nukleotidů pak budou odstraněna. Čtení s nízkou složitostí budou odfiltrována pomocí PRINSEQ verze 0.20.4. Duplikáty PCR budou odstraněny pomocí Picard verze 2.8.0 (http://broadinstitute.github.io/picard). Zpracované vysoce kvalitní a čisté čtení v každé knihovně budou použity v následných analýzách. V komunitní analýze založené na metagenomických sekvencích budou pomocí softwaru Metaxa2 identifikovány sekvence genu malé podjednotky (SSU) rRNA. Přiřazení taxonomie bude provedeno na základě výsledků vyhledávání BLAST proti databázi SILVA123 pomocí programu MEGAN [23] s následujícím nastavením: Min Support 1, Min Score 50, Max Expected 1xe-5, Top Percent 10,0. Složení genové komunity SSU rRNA bylo porovnáno mezi metagenomickými knihovnami.

Metabolomická studie. Příprava vzorků. Vzorky budou připraveny pomocí automatizovaného robotického systému MicroLab STARR (Hamilton Company, Salt Lake City, UT, USA). Pro účely kontroly kvality (QC) se do 100 l vzorků séra před prvním krokem procesu extrakce přidá výtěžný standard. Proteiny se vysrážejí methanolem intenzivním třepáním po dobu 2 minut. Dále budou vzorky odstředěny, aby se odstranily proteiny, disociovaly se malé molekuly navázané na proteiny nebo zachycené ve vysrážené proteinové matrici a aby se získaly chemicky různorodé metabolity (Glen Mills GenoGrinder 2000, Libanon, USA). Poté se vzorky umístí na TurboVapR (Zymark, Kalifornie, USA), aby se odstranilo organické rozpouštědlo. Pro analýzu kapalinovou chromatografií (LC) budou vzorky před přípravou skladovány přes noc v dusíku. Pro analýzu plynovou chromatografií (GC) se každý vzorek před přípravou suší přes noc ve vakuu.

Kontroly kvality. Paralelně s experimentálními vzorky bude provedeno několik typů kontrolních experimentů. Vzorek sdružené matrice, vytvořený odebráním malého objemu každého experimentálního vzorku, bude sloužit jako technický replikát v celém extrahovaném souboru dat. Alikvoty vody budou sloužit jako polotovary. Navíc bude do každého analyzovaného vzorku přidán koktejl standardů QC pečlivě vybraných tak, aby neinterferovaly s měřením endogenních sloučenin. To umožní monitorování výkonu přístroje a pomůže při chromatografickém zarovnání. Variabilita přístroje bude stanovena výpočtem střední relativní směrodatné odchylky (RSD) pro standardy, které budou přidány ke každému vzorku před nástřikem do hmotnostních spektrometrů (MS). Celková variabilita procesu bude stanovena výpočtem mediánu RSD pro všechny endogenní metabolity (tj. nepřístrojové standardy) přítomné ve 100 % spojených vzorků matrice. Experimentální vzorky budou náhodně rozděleny do běhu platformy, přičemž vzorky QC budou rozmístěny každých 5 nebo 10 injekcí, aby se ověřila celková účinnost testu. Vnitřní standardy budou použity k měření variability přístroje a budou mít medián RSD 3 %. Navíc celková variabilita procesu bude 8 %.

Ultravýkonná kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie. Část platformy pro kapalinovou chromatografii/hmotnostní spektrometrii (LC/MS), která má být použita, bude využívat ultravýkonnou kapalinovou chromatografii Waters ACQUITY (UPLC), Thermo Scientific Q-Exactive s vysokým rozlišením/přesnou MS propojenou s vyhřívanou elektrosprejovou ionizací ( HESI-II) a hmotnostní analyzátor Orbitrap pracovaly s hmotnostním rozlišením 35 000. Extrakt vzorku bude vysušen a rekonstituován v kyselých nebo zásaditých rozpouštědlech kompatibilních s LC, z nichž každé bude obsahovat osm nebo více injektovaných QC standardů v pevných koncentracích, aby se zajistila nástřiková a chromatografická konzistence. Jeden alikvot bude analyzován za použití kyselých, pozitivních iontově optimalizovaných podmínek a další bude proveden za bazických, negativních iontově optimalizovaných podmínek ve dvou nezávislých nástřikech s použitím samostatných vyhrazených kolon (Waters UPLC BEH C18-2,1 × 100 mm, 1,7 m). Extrakty rekonstituované v kyselých podmínkách budou gradientově eluovány z C18 kolony za použití vody a methanolu obsahujícího 0,1% kyselinu mravenčí. Druhý alikvot ze základního extraktu bude podobně eluován z C18 kolony za použití methanolu, vody a 6,5 ​​mM hydrogenuhličitanu amonného. Třetí alikvot bude analyzován negativní ionizací po eluci z chromatografické kolony s hydrofilní interakcí (Waters UPLC BEH Amide 2,1 x 150 mm, 1,7 m) za použití gradientu sestávajícího z vody a acetonitrilu s 10 mM mravenčanem amonným.

Plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie. Vzorky určené pro analýzu pomocí GC-MS budou sušeny ve vakuu po dobu minimálně 18 hodin, než budou derivatizovány pod sušeným dusíkem bistrimethylsilyltrifluoracetamidem. Derivatizované vzorky budou separovány na 5% difenyl/95% dimethylpolysiloxanové koloně taveného oxidu křemičitého (20 m × 0,18 mm vnitřní průměr; tloušťka filmu 0,18 m) s heliem jako nosným plynem a teplotní rampou od 60 °C do 340 °C přes 17,5- min perioda. Vzorky budou analyzovány na Thermo-Finnigan Trace DSQ rychle snímajícím jednokvadrupólovém MS s použitím ionizace dopadem elektronů (EI) provozované při jednotkové hmotnostní rozlišovací schopnosti. Rozsah skenování bude 50-750 m/z.

Extrakce dat a identifikace sloučenin. Surová data budou extrahována a píky budou zarovnány a identifikovány. QC budou zpracovány pomocí specifického hardwaru a softwaru. Píky budou kvantifikovány pomocí výpočtu plochy pod křivkou (AUC). Sloučeniny budou identifikovány porovnáním dat se záznamy knihovny purifikovaných standardů nebo opakujících se neznámých entit. Biochemické identifikace budou založeny na třech kritériích: retenční index (RI) v úzkém RI okně navrhované identifikace, přesná hmotnostní shoda s knihovnou ± 0,005 amu a MS/MS dopředné a zpětné skóre mezi experimentálními daty. a autentické standardy. Skóre MS/MS bude založeno na srovnání iontů přítomných v experimentálním spektru s ionty přítomnými ve spektru knihovny. I když mohou existovat podobnosti mezi těmito molekulami na základě jednoho z těchto faktorů, použití všech tří datových bodů může být využito k rozlišení a rozlišení biochemikálií s přesností.

Kvantifikace expozice EDC ve vzorcích moči. Analýza neperzistentních EDC bude provedena disperzní kapalinovou mikroextrakce (DLLME) a ​​ultravysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií (UHPLC-MS/MS). Stručně, vzorky moči se úplně rozmrazí při teplotě místnosti, odstřeďují se při 2600 x g po dobu 10 minut, aby se sedimentovaly částice a odebere se 0,75 ml pro provedení analýzy. Aby se určilo celkové množství EDC (volné plus konjugované), každý vzorek se nastříkal 50 μl enzymového roztoku (β-glukuronidáza/sulfatáza) a inkuboval se při 37 °C po dobu 24 hodin. Ošetřená moč se umístí do 15ml skleněné zkumavky se šroubovacím uzávěrem a přidá se 30 μl náhradního standardního roztoku (1,25 mg/l BPA-d16). Moč se zředí na 10,0 ml 5% vodným roztokem NaCl (w/v) a pH se upraví na 2,0. Dále se smíchá 0,75 ml acetonu a 0,75 ml trichlormethanu a injekční stříkačkou se rychle vstříkne do vodného vzorku. Po ručním protřepání, odstředění a odpaření extraktu se zbytek rozpustí ve 100 μl směsi skládající se z vody (0,1 % amoniaku)/acetonitrilu (0,1 % amoniaku), 70:30 (v/v) a nakonec 10 μl se vstřikuje do LC systému. Koncentrace kreatininu v moči je stanovena pomocí automatického kolorimetrického stanovení ve stejných vzorcích moči, ve kterých je hodnocena environmentální chemická látka.

Kvantifikace koncentrací mateřských estrogenů a metabolitů estrogenů v moči. Koncentrace estronu, estradiolu a 13 metabolitů estrogenu budou stanoveny s ohledem na hladiny kreatininu v moči (mg/dl). Kvantifikace estrogenů v moči bude hodnocena plynovou chromatografií tandemovou hmotnostní spektrometrií s použitím trojitého kvadrupólového analyzátoru. Stručně, jeden ml moči s 25 ul roztoku vnitřních standardů se extrahuje pomocí C18 SPE kazety (Sep-Pack C18) předem upravené 4 ml methanolu a 4 ml vody. Po nanesení vzorku moči se patrona promyje 4 ml vody. Ošetřená moč se poté odpaří. K odpaření se přidají 3 ml acetátového pufru 0,1 M (pH 4,5) a 3 ul p-glukuronidázy a směs se inkubuje 3 hodiny při 55 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se pH zvýšilo na přibližně 9,5. Poté se vzorky extrahují 6 ml terc-butylmethyletheru třepáním a odstředí. Nakonec se organická vrstva odpaří do sucha pod proudem dusíku.

Další zdroje informací a kovariáty. Budou zaznamenány antropometrické, sociodemografické a reprodukční rysy účastníků. Rovněž udělí povolení k přístupu ke své klinické historii. Zaznamenají se rysy nádoru a stravovací návyky.