심한 천식(P-CLESA)에서 순환 및 폐 상주 호산구의 표현형 분석 (P-CLESA)

배경: 중증 천식은 "'제어되지 않는' 것을 방지하기 위해 고용량 흡입 코르티코스테로이드(ICS)와 두 번째 조절제(및/또는 전신 코르티코스테로이드)로 치료해야 하거나 이 요법에도 불구하고 '제어되지 않는' 상태로 유지되는 천식"으로 정의되었습니다. (1), 관리하기 가장 어려운 참가자 그룹을 나타냅니다. 그것은 이질적인 조건이며 수학적 접근 방식을 사용하여 유럽, 미국 및 아시아의 코호트에서 임상 하위 유형(표현형)을 정의했습니다. 항IgE 항체(omalizumab), 항Interleukin(IL)-5/anti-IL5Rα항체(Mepolizumab, reslizumab, benralizumab), 항IL4Rα(dupilumab) 등 단일클론항체 치료제가 도입되면서 개인 맞춤형 의료가 시작됐다. 이러한 요법은 각각 호산구(호산구성 천식)라고 하는 특정 유형의 염증 세포 수가 증가한 알레르기 환자 및/또는 천식 환자에게 효과적이기 때문입니다. 이러한 표적 치료법의 도입은 중증 천식, 특히 호산구성 중증 천식이 있는 참가자의 비율을 도왔지만 이러한 표현형의 기본이 되는 모든 운전 경로를 더 잘 이해하면 더 많은 진전이 있을 것입니다.

호산구 호산구의 생물학과 기능은 세포질에 독성 양이온 단백질을 포함하는 특정 이차 과립의 존재를 특징으로 합니다(2). 호산구 생물학에 대한 연구에 따르면 호산구는 사이토카인 생성 및 기도 염증 발생을 포함하여 다양한 방식으로 기능합니다. 생리학적 조건 하에서 적은 수의 호산구만이 골수에서 방출됩니다. 그러나 호산구 생산은 천식과 같은 알레르기 질환과 관련된 소위 Th2 세포 반응의 결과로 극적으로 증가합니다(2-4). 호산구가 항상성 면역 과정에 기여한다는 증거도 있습니다(4, 5). 이러한 호산구 생성 증가는 전용 사이토카인 세트, 즉 IL-3, IL-5 및 과립구 대식세포-CSF(GM-CSF)에 의해 촉진됩니다(2, 4). 이 중에서 Th2 관련 사이토카인 IL-5는 호산구 계통에 가장 특이적인 사이토카인이며 골수 전구 세포에서 호산구의 확장, 혈액으로의 방출 및 조직으로의 이동 후 생존을 담당합니다(2, 4, 6). 손상 부위에서 호산구는 미리 형성된 사이토카인 및 지질 매개체뿐만 아니라 세포독성 과립 단백질을 방출하여 염증 및 조직 손상을 악화시킬 수 있으며, 이는 Th2 반응이 알레르겐에 대해 지시될 때 특히 해롭습니다(2, 4).

순환계에서 호산구를 모집하려면 혈액 호산구가 활성화되어 활성화된 내피에 호산구가 부착되고 백혈구가 모세혈관에서 주변 조직으로 이동하게 됩니다(일혈(extravasation)(7, 8)). 혈관 내 호산구의 정지 및 기도 벽으로 그리고 기관지 조직 및 상피를 통해 기도 내강으로의 혈관외 유출은 인테그린(7, 8)이라고 하는 일련의 단백질에 의해 매개됩니다. 알레르기나 천식이 있는 피험자의 혈액 호산구는 정상 지원자의 호산구에 비해 유착이나 이동 정도가 더 큽니다(9).

Mepolizumab 치료 반응에 대한 약력학적 바이오마커 Mepolizumablizumab은 혈액 및 조직 호산구(11)의 조절을 담당하는 주요 T2 사이토카인인 인간 IL-5(10)에 높은 특이성과 친화도로 결합합니다. Mepolizumab은 IL-5가 호산구 세포 표면에 발현된 IL-5 수용체 복합체와 결합하는 것을 방지하여 IL-5 신호 전달을 억제하여 호산구 생존 및 증식을 차단합니다. IL-5 억제제의 정확한 작용 기전은 완전히 밝혀지지 않았지만, 치료 효과를 달성하기 위해 혈액 및 조직 및 폐, 특히 폐에서 활성화된 호산구의 효과를 중화시키는 것이 바람직한 목표이다.

천식에서 호산구 과발현과 천식 중증도 사이의 연관성은 1990년에 만들어졌으며(12) 이후 연구에서는 혈액 또는 객담 호산구 수가 중증 호산구성 천식 참가자를 특성화하는 데 사용될 수 있다는 견해를 반복했습니다(13). SIRIUS 시험에서 Mepolizumab 100mg을 피하 투여하면 일일 경구 코르티코스테로이드의 필요성이 감소하는 동시에 천식 조절, 폐 기능, 삶의 질이 개선되고 악화가 감소하는 것으로 나타났습니다(14). MENSA 시험에서 Mepolizumab으로 치료받은 참가자들은 악화가 상당히 감소했고 천식 조절 설문지 점수가 개선되었다고 보고했습니다(15). Mepolizumab 연구자들은 중증 호산구성 천식에 대한 접근 가능한 바이오마커를 제공하는 Mepolizumab의 임상적 효능에 대한 좋은 예측 인자로서 객담 호산구가 아닌 혈액 호산구를 확인했습니다. 또한, DREAM(17) 및 MENSA(15) 연구의 2차 분석(16)에서 베이스라인 호산구 수가 ≥150-300 cells/µl 및 ≥300 cells/µl인 중증 천식 참가자에서 Mepolizumab의 임상적 효능이 확인되었습니다.

천식에서 호산구의 하위 집합 생쥐에서 호산구의 하위 집합이 확인되었습니다(18). 분절된 핵을 가진 IL-5 의존 세포로 정의됩니다. 쥐 천식 모델에서 Mesnil과 동료들은 폐 rEos의 특징은 변하지 않았지만 rEos는 폐에서 iEos와 함께 국소화되었으며 rEos가 없는 쥐는 흡입 알레르겐에 대한 Th2 세포 반응이 증가했다고 보고했습니다. 인간에 대한 연구에서 비천식 인간 폐에서 발견되는 실질 rEos는 호산구성 천식 환자의 객담에서 분리된 iEos와 표현형적으로 구별되는 것으로 보고되었습니다. 이 데이터는 인간의 호산구의 독특한 순환계 및 폐 상주 하위 집합의 존재를 강조합니다.

호산구는 지질 매개체 류코트리엔(2, 19)과 같은 세포독성 과립 성분 사이토카인 및 케모카인을 포함하여 천식 병리에 관련된 많은 분자를 분비합니다. 호산구 활성화와 천식에서 IL-5의 역할은 확인되었지만 천식과 관련된 GM-CSF 및 IL-3와 같은 다른 사이토카인의 비교 활성은 아직 완전히 결정되지 않았습니다. 에오탁신(CCL11 및 CCL24)은 호산구를 기도로 모집하는 데 관여하는 중요한 케모카인으로 간주되는 반면 IL-4 및 IL-3는 중증 천식 환자의 기도에서 과발현되는 것으로 보고되었습니다(20, 21). 이러한 Th2 유형 사이토카인 외에도 IFN 및 TNFα는 또한 호산구를 상향 조절하고 생존을 연장합니다(22, 23). 또한, 활성화된 호산구에 존재하는 TSLPR, IL33R 및 CCR3 수용체는 중증 호산구성 천식에서 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. 단백질 발현은 중증 천식과 관련된 근본적인 병태생리학적 신호 전달 경로에 대한 더 나은 이해를 제공할 것입니다.

관찰 연구 이것은 중증 천식 관리를 위해 합의된 영국 지침에 따라 후속 조치를 취하고 관리되는 중증 천식 진단을 받은 참가자에 대한 관찰 연구입니다. 이 그룹에서 참가자는 혈중 호산구 수에 따라 Mepolizumab으로 치료를 받게 됩니다. 이 참가자들은 혈액 및 폐 transcriptomics 및 proteomics의 분석에 의해 호산구성 분자 표현형에 따라 모집되고 표현형이 지정됩니다. 참가자는 0, 3 및 12개월에 평가됩니다. 부수적인 임상 소견은 정당한 대로 임상 팀과 GP에게 전달됩니다.

연구 근거 중증 천식에서 순환 호산구와 폐 상주 호산구의 하위 집합과 항-IL-5 요법 효능 사이의 관계는 조사되지 않았습니다.

목적 베이스라인에서 중증 천식이 있는 참가자와 Mepolizumablizumab 요법에서 순환 및 기도, 특히 혈액 및 조직 상주에서 호산구의 전사체 및 매개체 프로필을 결정합니다.

연구 모델 기준선과 Mepolizumab(항-IL-5 Rx) 치료 후 시점에서 중증 천식이 있는 생물학적 순진한 참여자에서 순환 및 폐 상주 호산구의 모든 하위 집합을 식별하기 위한 편견 없는 연구. 중증 천식 참가자(Eos>300/ul)는 Royal Brompton 병원의 중증 천식 클리닉에서 모집되며 가능한 한 참가자는 OCS 요법을 받지 않습니다.

1차 목표 (i) 한 시점에서 중증 천식이 있는 참가자의 순환 호산구의 표현형 하위 집합 (ii) 1년 동안 Mepolizumab 요법에 대한 중증 천식이 있는 참가자의 순환 및 폐 호산구의 표현형 하위 집합.

연구 1: 한 시점에서 중증 천식이 있는 참가자의 순환 호산구의 표현형 하위 집합

모집: 유지 관리 OCS가 아닌 생물학적 순진한 SA 15명 및 현재 메폴리주맙 요법을 받고 있으며 우수한 임상 반응을 보이는 SA 15명.

이 참가자들로부터 혈액 샘플(90ml)을 채취합니다. 혈액 호산구는 동일한 세포에서 유전자 및 세포 표면 단백질 발현을 동시에 측정하여 하위 유형(표현형)이 될 이러한 샘플로부터 분리될 것입니다. 혈액 호산구는 또한 실험실에서 세포 배양되고 다양한 사이토카인과 케모카인으로 자극되어 염증 매개체의 방출이 결정됩니다. 이를 통해 천식 호산구의 세포 이질성에 대한 이해를 높이고 미치료 참가자와 Mepolizumablizumab 치료 참가자의 말초 혈액 호산구 집단 간의 차이를 확인할 수 있습니다.

연구 2: 1년 동안 Mepolizumab 요법에 대한 중증 천식 참가자의 순환 및 폐 호산구의 표현형 하위 집합.

중증 천식 참가자 36명을 모집하여 OCS 유지 요법이 아닌 중증 천식 환자(Eos>300/ul)를 적절하게 특성화하여 30명의 참가자로부터 쌍을 이룬 생검 샘플을 얻습니다.

혈액 샘플은 베이스라인, 메폴리주맙 요법 후 3개월 및 12개월에 채취될 것입니다. 그런 다음 동일한 세포에서 유전자와 세포 표면 단백질 발현을 동시에 측정하여 혈액 호산구를 분리하고 표현형을 결정합니다. 혈액 호산구는 또한 실험실에서 세포 배양되고 다양한 사이토카인과 케모카인으로 자극되어 염증 매개체의 방출이 결정됩니다. 이를 통해 Mepolizumab 치료 후 천식 호산구의 세포 이질성에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

기관지경 검사는 36명의 참가자에 대해 수행되며 기준선에서 기관지 폐 생검을 샘플링하고 Mepolizumab 치료 1년 후; 2차 시술은 마지막 메폴리주맙 주사 후 2주 이내에 시행합니다. 단일 세포 RNA-seq 10xGenomics 및 bulk -RNA -seq는 Gronigen 그룹의 최적화된 프로토콜을 사용하여 베이스라인 및 Mepolizumab 치료 1년 후 폐 조직의 효소 분해(4oC에서)를 통해 폐 조직 호산구에서 수행됩니다. 면역조직화학(IHC)도 세포 내용물 및 구조를 특성화하기 위해 수행될 것입니다. 4개의 생검은 RNA-seq용으로, 2개는 IHC용으로 예약됩니다.