Fenotypowanie krążących i rezydujących w płucach eozynofili w ciężkiej astmie (P-CLESA) (P-CLESA)

Wstęp: Ciężka astma została zdefiniowana jako „astma wymagająca leczenia kortykosteroidami wziewnymi w dużych dawkach (ICS) w połączeniu z drugim lekiem kontrolującym (i/lub kortykosteroidami działającymi ogólnoustrojowo), aby zapobiec „niekontrolowaniu” astmy lub pozostawaniu „niekontrolowanej” pomimo tej terapii”. (1), reprezentujący najtrudniejszą do zarządzania grupą uczestników. Jest to stan niejednorodny, a zastosowanie podejść matematycznych doprowadziło do zdefiniowania podtypów klinicznych (fenotypów) z kohort w Europie, USA i Azji. Wraz z wprowadzeniem terapii przeciwciałami monoklonalnymi, takimi jak przeciwciało anty-IgE (omalizumab), przeciwciało anty-interleukina (IL)-5/anty-IL5Rα (Mepolizumab, reslizumab i benralizumab) oraz anty-IL4Rα (dupilumab), zapoczątkowano medycynę spersonalizowaną ponieważ terapie te są skuteczne u pacjentów z alergią i (lub) u pacjentów z astmą ze zwiększoną liczbą określonego typu komórek zapalnych, zwanych odpowiednio eozynofilami (astma eozynofilowa). Wprowadzenie tych ukierunkowanych terapii pomogło odsetkowi uczestników z ciężką astmą, zwłaszcza z ciężką astmą eozynofilową, ale dalsze postępy nastąpią wraz z lepszym zrozumieniem wszystkich ścieżek napędzających leżących u podstaw tych fenotypów.

Biologia i funkcja eozynofilów Eozynofile charakteryzują się obecnością w cytoplazmie specyficznych ziarnistości wtórnych zawierających toksyczne białka kationowe(2). Badania naukowe nad biologią eozynofili wskazują, że eozynofile działają na wiele sposobów, w tym produkcję cytokin i rozwój zapalenia dróg oddechowych. W warunkach fizjologicznych ze szpiku kostnego uwalniana jest tylko niewielka liczba eozynofili. Jednak produkcja eozynofilów dramatycznie wzrasta w wyniku tak zwanych odpowiedzi komórek Th2 związanych z chorobami alergicznymi, takimi jak astma (2-4). Istnieją również dowody na to, że eozynofile przyczyniają się do homeostatycznych procesów immunologicznych (4, 5). Ten wzrost produkcji eozynofili jest napędzany przez dedykowany zestaw cytokin, a mianowicie IL-3, IL-5 i makrofag granulocytów-CSF (GM-CSF) (2, 4). Spośród nich cytokina IL-5 związana z Th2 jest najbardziej specyficzną cytokiną dla linii eozynofili i jest odpowiedzialna za ekspansję eozynofili z komórek progenitorowych szpiku kostnego, ich uwalnianie do krwi i przeżycie po migracji do tkanek(2, 4, 6). W miejscu urazu eozynofile mogą uwalniać swoje cytotoksyczne białka ziarniste, a także preformowane cytokiny i mediatory lipidowe, co prowadzi do zaostrzenia stanu zapalnego i uszkodzenia tkanki, co jest szczególnie szkodliwe, gdy odpowiedzi Th2 są skierowane przeciwko alergenom (2, 4).

Rekrutacja eozynofilów z krążenia wymaga aktywacji eozynofili we krwi, co prowadzi do ich przyczepienia się do aktywowanego śródbłonka i przemieszczania krwinek białych z naczyń włosowatych do otaczających je tkanek (wynaczynienie(7, 8)). W zatrzymaniu eozynofili w naczyniach i ich wynaczynieniu do ściany dróg oddechowych oraz przez tkankę oskrzelową i nabłonek do światła dróg oddechowych pośredniczy zespół białek zwanych integrynami(7, 8). Eozynofile we krwi pacjentów z alergią lub astmą mają większy stopień adhezji lub migracji w porównaniu z tymi pochodzącymi od zdrowych ochotników (9).

Biomarkery farmakodynamiczne odpowiedzi na leczenie mepolizumabem Mepolizumablizumab wiąże się z wysoką specyficznością i powinowactwem do ludzkiej IL-5(10), kluczowej cytokiny T2 odpowiedzialnej za regulację liczby eozynofilów we krwi i tkankach(11). Mepolizumab zapobiega wiązaniu IL-5 z kompleksem receptora IL-5, którego ekspresja występuje na powierzchni komórek eozynofili, a tym samym hamuje przekazywanie sygnałów przez IL-5, blokując przeżycie i proliferację eozynofili. Chociaż dokładny mechanizm działania inhibitorów IL-5 nie jest w pełni wyjaśniony, pożądanym celem jest zneutralizowanie działania aktywowanych granulocytów kwasochłonnych we krwi i tkankach oraz płucach, zwłaszcza w płucach w przypadku astmy, w celu uzyskania efektu terapeutycznego.

W przypadku astmy w 1990 roku (12) stwierdzono związek między nadekspresją eozynofili a ciężkością astmy, a późniejsze badania potwierdziły pogląd, że liczba eozynofili we krwi lub w plwocinie może być wykorzystana do scharakteryzowania uczestników z ciężką astmą eozynofilową (13). W badaniu SIRIUS wykazano, że mepolizumab w dawce 100 mg podawany podskórnie zmniejsza zapotrzebowanie na codzienne doustne kortykosteroidy, jednocześnie poprawiając kontrolę astmy, czynność płuc i jakość życia oraz zmniejszając liczbę zaostrzeń(14). W badaniu MENSA uczestnicy leczeni mepolizumabem zgłaszali znamienne zmniejszenie częstości zaostrzeń oraz poprawę wyników kwestionariusza kontroli astmy(15). Badacze Mepolizumabu zidentyfikowali eozynofile we krwi, a nie eozynofile w plwocinie, jako dobry predyktor klinicznej skuteczności mepolizumabu, dostarczając dostępnego biomarkera ciężkiej astmy eozynofilowej. Ponadto analiza wtórna(16) badań DREAM(17) i MENSA(15) wykazała skuteczność kliniczną mepolizumabu u pacjentów z ciężką astmą z wyjściową liczbą eozynofilów ≥150-300 komórek/µl i ≥300 komórek/µl.

Podgrupy eozynofili w astmie U myszy zidentyfikowano podgrupy eozynofili(18): i) eozynofile rezydujące w płucach (rEos), które są komórkami niezależnymi od IL-5 z jądrem w kształcie pierścienia oraz ii) eozynofile zapalne (iEos), które zdefiniowane jako komórki zależne od IL-5 z segmentowanym jądrem. W mysim modelu astmy Mesnil i współpracownicy stwierdzili, że cechy rEos w płucach pozostały niezmienione, ale rEos były zlokalizowane razem z iEos w płucach, a myszy pozbawione rEos miały zwiększoną odpowiedź komórek Th2 na wziewne alergeny. Badania na ludziach dowiodły, że miąższowe rEo znalezione w ludzkich płucach bez astmy różniły się fenotypowo od iEos wyizolowanych z plwociny eozynofilowych pacjentów z astmą. Dane te podkreślają istnienie charakterystycznych podgrup eozynofili rezydujących w krążeniu i płucach u człowieka.

Eozynofile wydzielają wiele cząsteczek zaangażowanych w patologię astmy, w tym cytokiny i chemokiny, takie jak mediatory lipidowe, leukotrieny(2, 19). Podczas gdy rola IL-5 została potwierdzona w aktywacji eozynofili i astmie, porównawcza aktywność innych cytokin, takich jak GM-CSF i IL-3, również zaangażowanych w astmę, nie została jeszcze w pełni określona. Uważa się, że eotaksyny (CCL11 i CCL24) są ważnymi chemokinami zaangażowanymi w rekrutację eozynofilów do dróg oddechowych, podczas gdy IL-4 i IL-3 ulegają nadekspresji w drogach oddechowych u chorych na ciężką astmę(20, 21). Oprócz tych cytokin typu Th2, IFN i TNFα również zwiększają regulację eozynofilów i przedłużają ich przeżycie(22, 23). Ponadto stwierdzono, że receptory TSLPR, IL33R i CCR3 obecne na aktywowanych eozynofilach są podwyższone w ciężkiej astmie eozynofilowej. ekspresja białka prawdopodobnie zapewni lepsze zrozumienie leżących u podstaw patofizjologicznych szlaków sygnałowych zaangażowanych w ciężką astmę.

Badanie obserwacyjne Będzie to badanie obserwacyjne uczestników, u których zdiagnozowano ciężką astmę, będących pod obserwacją i leczonych zgodnie z uzgodnionymi brytyjskimi wytycznymi dotyczącymi leczenia ciężkiej astmy. W tej grupie uczestnicy będą leczeni mepolizumabem w zależności od liczby eozynofili we krwi. Uczestnicy ci zostaną zrekrutowani i fenotypowani zgodnie z eozynofilowym fenotypem molekularnym poprzez analizę transkryptomiki i proteomiki krwi i płuc. Uczestnicy zostaną poddani ocenie w wieku 0, 3 i 12 miesięcy. Przypadkowe odkrycie kliniczne zostanie przekazane zespołowi klinicznemu i lekarzowi pierwszego kontaktu, jeśli jest to uzasadnione.

Uzasadnienie badania Nie zbadano związku między podgrupami eozynofilów krążących i rezydujących w płucach w ciężkiej astmie a skutecznością terapii anty-IL-5.

Cele Określenie profili transkryptomicznych i mediatorów eozynofili z krążenia i dróg oddechowych, w szczególności rezydujących we krwi i tkankach, u uczestników z ciężką astmą na początku badania iw trakcie leczenia mepolizumablizumabem.

Model badania Bezstronne badanie mające na celu identyfikację wszystkich podgrup eozynofilów krążących i rezydujących w płucach u nieleczonych biologicznie uczestników z ciężką astmą na początku badania iw punktach czasowych po leczeniu mepolizumabem (anty-IL-5 Rx). Osoby z ciężką astmą (Eos>300/ul) będą rekrutowane z kliniki ciężkiej astmy w Royal Brompton Hospital i, o ile to możliwe, uczestnicy nie będą poddawani terapii OCS.

Główne cele (i) Podgrupy fenotypowe krążących eozynofilów od uczestników z ciężką astmą w jednym punkcie czasowym (ii) Podgrupy fenotypowe krążących i płucnych eozynofili od uczestników z ciężką astmą leczonych mepolizumabem w ciągu jednego roku.

Badanie 1: Podgrupy fenotypowe krążących eozynofili u uczestników z ciężką astmą w jednym punkcie czasowym

Rekrutacja: 15 SA naiwnych biologicznie, nie stosujących podtrzymujących OCS i 15 SA obecnie leczonych mepolizumabem z dobrą odpowiedzią kliniczną.

Od tych uczestników zostaną pobrane próbki krwi (90 ml). Eozynofile krwi zostaną wyizolowane z tych próbek, które następnie zostaną poddane podtypowaniu (fenotypowi) przez równoczesny pomiar ekspresji genów i białek powierzchniowych w tej samej komórce. Eozynofile we krwi będą również hodowane w laboratorium i stymulowane różnymi cytokinami i chemokinami w celu określenia uwalniania mediatorów stanu zapalnego. Razem zwiększy to naszą wiedzę na temat heterogenności komórkowej eozynofili chorych na astmę i pozwoli zidentyfikować różnicę między populacjami eozynofili we krwi obwodowej u uczestników nieleczonych i leczonych mepolizumablizumabem.

Badanie 2: Podgrupy fenotypowe krążących i płucnych eozynofili od uczestników z ciężką astmą leczonych mepolizumabem przez rok.

Zwerbuj 36 uczestników z ciężką astmą, odpowiednio scharakteryzowanych z ciężką astmą (Eos>300/ul), nie stosujących terapii podtrzymującej OCS, aby uzyskać sparowane próbki biopsji od 30 uczestników

Próbki krwi będą pobierane na początku badania, 3 i 12 miesięcy po leczeniu mepolizumabem. Eozynofile we krwi zostaną następnie wyizolowane i fenotypowane przez równoczesny pomiar ekspresji genów i białek powierzchniowych w tej samej komórce. Eozynofile we krwi będą również hodowane w laboratorium i stymulowane różnymi cytokinami i chemokinami w celu określenia uwalniania mediatorów stanu zapalnego. Razem przyczyni się to do lepszego zrozumienia heterogenności komórkowej eozynofili chorych na astmę po leczeniu mepolizumabem.

Bronchoskopia zostanie przeprowadzona u 36 uczestników, pobranie biopsji płuca z wnętrza oskrzeli na początku badania i 1 rok po leczeniu mepolizumabem; drugi zabieg zostanie wykonany w ciągu 2 tygodni od ostatniego wstrzyknięcia mepolizumabu. Sekwencja pojedynczej komórki RNA-seq 10xGenomics i masowa sekwencja -RNA-seq zostanie przeprowadzona, przy użyciu zoptymalizowanego protokołu grupy Gronigen, na eozynofilach tkanki płucnej poprzez enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej (w temperaturze 4oC) na początku badania i rok po leczeniu mepolizumabem. Przeprowadzona zostanie również immunohistochemia (IHC) w celu scharakteryzowania zawartości i struktury komórkowej. Cztery biopsje zostaną zarezerwowane dla RNA-seq i dwie dla IHC.