Fenotipagem de eosinófilos circulantes e residentes pulmonares na asma grave (P-CLESA) (P-CLESA)

Introdução: A asma grave foi definida como "asma que requer tratamento com altas doses de corticosteroides inalatórios (CI) mais um segundo controlador (e/ou corticosteroides sistêmicos) para evitar que se torne 'descontrolada' ou que permaneça 'descontrolada' apesar desta terapia" (1), representando um grupo de participantes muito difícil de gerenciar. É uma condição heterogênea e o uso de abordagens matemáticas levou à definição de subtipos clínicos (fenótipos) de coortes na Europa, EUA e Ásia. Com a introdução de terapias com anticorpos monoclonais, como anticorpo anti-IgE (omalizumab), anticorpo anti-Interleucina (IL)-5/anti-IL5Rα (Mepolizumab, reslizumab e benralizumab) e anti-IL4Rα (dupilumab), iniciou-se a medicina personalizada pois essas terapias são eficazes em pacientes com alergia e/ou em pacientes com asma com números aumentados de um tipo particular de célula inflamatória chamada eosinófilo (asma eosinofílica), respectivamente. A introdução dessas terapias direcionadas ajudou uma proporção de participantes com asma grave, particularmente aqueles com asma grave eosinofílica, mas mais progressos virão com uma melhor compreensão de todas as vias de condução subjacentes a esses fenótipos.

A biologia e a função dos eosinófilos Os eosinófilos são caracterizados pela presença de grânulos secundários específicos, em seu citoplasma, contendo proteínas catiônicas tóxicas(2). Estudos de pesquisa sobre a biologia dos eosinófilos indicam que os eosinófilos funcionam de várias maneiras, incluindo a produção de citocinas e o desenvolvimento de inflamação das vias aéreas. Sob condições fisiológicas, apenas um pequeno número de eosinófilos é liberado da medula óssea. No entanto, a produção de eosinófilos é dramaticamente aumentada como resultado das chamadas respostas das células Th2 associadas a doenças alérgicas como a asma (2-4). Também há evidências de que os eosinófilos contribuem para processos imunes homeostáticos (4, 5). Este aumento na produção de eosinófilos é impulsionado por um conjunto dedicado de citocinas, ou seja, IL-3, IL-5 e granulócitos macrófagos-CSF (GM-CSF) (2, 4). Dentre elas, a citocina IL-5 associada a Th2 é a citocina mais específica para a linhagem eosinófila e é responsável pela expansão de eosinófilos de progenitores da medula óssea comprometidos, sua liberação no sangue e sua sobrevivência após a migração para os tecidos(2, 4, 6). No local da lesão, os eosinófilos podem liberar suas proteínas granulares citotóxicas, bem como citocinas pré-formadas e mediadores lipídicos, para exacerbação da inflamação e dano tecidual, o que é particularmente deletério quando as respostas Th2 são direcionadas contra alérgenos (2, 4).

O recrutamento de eosinófilos da circulação requer que os eosinófilos do sangue se tornem ativados, levando à sua ligação ao endotélio ativado e ao movimento dos glóbulos brancos dos capilares para os tecidos circundantes (extravasamento (7, 8)). A retenção de eosinófilos nos vasos e seu extravasamento para a parede das vias aéreas e através do tecido brônquico e epitélio para o lúmen das vias aéreas são mediados por um conjunto de proteínas denominadas integrinas(7, 8). Os eosinófilos sanguíneos de indivíduos com alergia ou asma têm um maior grau de adesão ou migração em comparação com os de voluntários normais (9).

Biomarcadores farmacodinâmicos para a resposta ao tratamento com mepolizumabe O mepolizumablizumabe liga-se com alta especificidade e afinidade à IL-5 humana(10), a principal citocina T2 responsável pela regulação dos eosinófilos sanguíneos e teciduais(11). O mepolizumabe impede que a IL-5 se ligue ao complexo receptor de IL-5 expresso na superfície da célula eosinófila e, assim, inibe a sinalização da IL-5, bloqueando a sobrevivência e a proliferação dos eosinófilos. Embora o mecanismo exato de ação dos inibidores da IL-5 não esteja totalmente elucidado, o objetivo desejado é neutralizar o efeito dos eosinófilos ativados no sangue e nos tecidos e no pulmão, principalmente no pulmão da asma, a fim de alcançar o efeito terapêutico.

Na asma, uma associação entre a superexpressão de eosinófilos e a gravidade da asma foi feita em 1990 (12) e estudos subsequentes desde então repetiram a visão de que a contagem de eosinófilos no sangue ou no escarro pode ser usada para caracterizar participantes com asma eosinofílica grave (13). No estudo SIRIUS, o mepolizumabe na dose de 100 mg administrado por via subcutânea demonstrou reduzir a necessidade de corticosteroides orais diários e, ao mesmo tempo, melhorar o controle da asma, a função pulmonar e a qualidade de vida e reduzir as exacerbações(14). No estudo MENSA, os participantes tratados com Mepolizumabe relataram exacerbações significativamente reduzidas e uma melhora nos escores do questionário de controle da asma(15). Os investigadores do Mepolizumab identificaram os eosinófilos no sangue, em vez dos eosinófilos na expectoração, como um bom preditor da eficácia clínica do Mepolizumab, fornecendo um biomarcador acessível para asma eosinofílica grave. Além disso, a análise secundária(16) dos estudos DREAM(17) e MENSA(15) identificou a eficácia clínica do Mepolizumab em participantes com asma grave com contagens basais de eosinófilos ≥150-300 células/µl e ≥300 células/µl.

Subconjuntos de eosinófilos na asma Em camundongos, subconjuntos de eosinófilos foram identificados(18): i) eosinófilos residentes no pulmão (rEos) que são células independentes de IL-5 com núcleo em forma de anel e ii) eosinófilos inflamatórios (iEos), que foram definidas como células dependentes de IL-5 com um núcleo segmentado. Em um modelo murino de asma, Mesnil e colegas relataram que as características de rEos pulmonares permaneceram inalteradas, mas rEos foram co-localizadas com iEos no pulmão e que camundongos sem rEos tiveram uma resposta aumentada de células Th2 a alérgenos inalados. Estudos no homem relataram que os rEos parenquimatosos encontrados em pulmões humanos não asmáticos eram fenotipicamente distintos dos iEos isolados do escarro de pacientes asmáticos eosinofílicos. Esses dados destacam a existência de subconjuntos circulatórios e pulmonares distintos de eosinófilos no homem.

Os eosinófilos secretam muitas moléculas envolvidas na patologia da asma, incluindo citocinas e quimiocinas constituintes dos grânulos citotóxicos, como os leucotrienos, mediadores lipídicos (2, 19). Embora o papel da IL-5 seja confirmado na ativação de eosinófilos e na asma, as atividades comparativas de outras citocinas, como GM-CSF e IL-3, também implicadas na asma, ainda não foram totalmente determinadas. As eotaxinas (CCL11 e CCL24) são consideradas quimiocinas importantes envolvidas no recrutamento de eosinófilos para as vias aéreas, enquanto IL-4 e IL-3 são relatados como superexpressos nas vias aéreas de asmáticos graves(20, 21). Além dessas citocinas do tipo Th2, os IFNs e TNFα também regulam positivamente os eosinófilos e prolongam sua sobrevida(22, 23). Além disso, descobriu-se que os receptores TSLPR, IL33R e CCR3 presentes nos eosinófilos ativados estavam elevados na asma eosinofílica grave (24). a expressão da proteína provavelmente fornecerá uma melhor compreensão das vias de sinalização fisiopatológicas subjacentes envolvidas na asma grave.

Estudo Observacional Este será um estudo observacional de participantes diagnosticados com asma grave sendo acompanhados e geridos de acordo com as diretrizes acordadas do Reino Unido para o tratamento da asma grave. Neste grupo, os participantes terão sido tratados com Mepolizumab de acordo com a contagem de eosinófilos no sangue. Esses participantes serão recrutados e fenotipados de acordo com o fenótipo molecular eosinofílico por meio de análises de transcriptômica e proteômica sanguínea e pulmonar. Os participantes serão avaliados aos 0, 3 e 12 meses. Achados clínicos incidentais serão encaminhados à equipe clínica e ao clínico geral, conforme justificado.

Justificativa do estudo A relação entre subconjuntos de eosinófilos circulantes e residentes no pulmão na asma grave e a eficácia da terapia anti-IL-5 não foi explorada.

Objetivos Determinar os perfis transcriptômicos e mediadores de eosinófilos da circulação e das vias aéreas, especificamente sangue e tecidos residentes, em participantes com asma grave no início do estudo e em terapia com Mepolizumablizumab.

Modelo de estudo Estudo imparcial para identificar todos os subconjuntos de eosinófilos circulantes e residentes no pulmão em participantes biológicos virgens com asma grave na linha de base e em pontos de tempo após o tratamento com Mepolizumab (anti-IL-5 Rx). Os participantes com asma grave (Eos>300/ul) serão recrutados na clínica de asma grave do Royal Brompton Hospital e, tanto quanto possível, os participantes não estarão em terapia OCS.

Objetivos Primários (i) Subconjuntos de fenótipos de eosinófilos circulantes de participantes com asma grave em um determinado momento (ii) Subconjuntos de fenótipos de eosinófilos circulantes e pulmonares de participantes com asma grave em terapia com Mepolizumabe durante um ano.

Estudo 1: Subconjuntos de fenótipos de eosinófilos circulantes em participantes com asma grave em um determinado momento

Recrutamento: 15 SA biológicos virgens sem OCS de manutenção e 15 SA atualmente em terapia com Mepolizumab com boa resposta clínica.

Amostras de sangue (90ml) serão coletadas desses participantes. Destas amostras serão isolados eosinófilos sanguíneos que serão então subtipados (fenótipo) medindo-se simultaneamente a expressão de genes e proteínas de superfície celular na mesma célula. Os eosinófilos do sangue também serão cultivados em laboratório e estimulados com uma variedade de citocinas e quimiocinas para determinar a liberação de mediadores inflamatórios. Juntos, isso aumentará nossa compreensão da heterogeneidade celular em eosinófilos asmáticos e identificará a diferença entre populações de eosinófilos no sangue periférico em participantes não tratados e tratados com mepolizumablizumabe.

Estudo 2: Subconjuntos de fenótipos de eosinófilos circulantes e pulmonares de participantes com asma grave em tratamento com Mepolizumabe durante um ano.

Recrutar 36 participantes com asma grave adequadamente caracterizados como asmáticos graves (Eos>300/ul), não em terapia de manutenção com OCS, para obter amostras de biópsia pareadas de 30 participantes

Amostras de sangue serão coletadas no início, 3 e 12 meses após a terapia com Mepolizumabe. Os eosinófilos sanguíneos serão então isolados e fenotipados medindo simultaneamente a expressão do gene e da proteína da superfície celular na mesma célula. Os eosinófilos do sangue também serão cultivados em laboratório e estimulados com uma variedade de citocinas e quimiocinas para determinar a liberação de mediadores inflamatórios. Juntos, isso aumentará nossa compreensão da heterogeneidade celular em eosinófilos asmáticos após a terapia com mepolizumabe.

A broncoscopia será realizada em 36 participantes, amostrando a biópsia pulmonar endobrônquica no início e 1 ano após a terapia com mepolizumabe; o segundo procedimento será realizado dentro de 2 semanas após a última injeção de Mepolizumab. Serão realizados 10xGenomics de RNA-seq de célula única e bulk -RNA -seq, usando o protocolo otimizado do grupo Gronigen, em eosinófilos do tecido pulmonar por meio da dissociação enzimática do tecido pulmonar (a 4oC) no início e 1 ano após a terapia com Mepolizumabe. A imuno-histoquímica (IHC) também será realizada para caracterizar o conteúdo e a estrutura celular. Quatro biópsias serão reservadas para RNA-seq e duas para IHC.