A keringő és tüdőben élő eozinofilek fenotipizálása súlyos asztmában (P-CLESA) (P-CLESA)

Háttér: A súlyos asztmát a következőképpen határozták meg: "az asztma, amely nagy dózisú inhalációs kortikoszteroidokkal (ICS) plusz egy második kontrollerrel (és/vagy szisztémás kortikoszteroidokkal) történő kezelést igényel, hogy megakadályozza, hogy a betegség „kontrollálatlanná” váljon, vagy amely a kezelés ellenére „kontrollálatlan” marad. (1), amely a résztvevők legnehezebben kezelhető csoportját képviseli. Ez egy heterogén állapot, és a matematikai megközelítések alkalmazása a klinikai altípusok (fenotípusok) meghatározásához vezetett európai, amerikai és ázsiai kohorszokból. Az olyan monoklonális antitestterápiák bevezetésével, mint az anti-IgE antitest (omalizumab), az anti-interleukin (IL)-5/anti-IL5Rα antitest (mepolizumab, reslizumab és benralizumab) és az anti-IL4Rα (dupilumab), személyre szabott orvoslás indult el. mivel ezek a terápiák hatásosak az allergiás és/vagy asztmás betegeknél, akiknél megnövekedett egy bizonyos típusú gyulladásos sejt, az úgynevezett eozinofil (eozinofil asztma) száma. Ezeknek a célzott terápiáknak a bevezetése segített a súlyos asztmában szenvedők egy részének, különösen az eozinofil súlyos asztmában szenvedőknek, de további előrelépést jelent az e fenotípusok mögött meghúzódó összes hajtóút jobb megértése.

Az eozinofil biológiája és működése Az eozinofilekre jellemző, hogy citoplazmájukban specifikus másodlagos szemcsék vannak, amelyek toxikus kationos fehérjéket tartalmaznak (2). Az eozinofil biológiával kapcsolatos kutatások azt mutatják, hogy az eozinofilek sokféle módon működnek, beleértve a citokintermelést és a légúti gyulladás kialakulását. Fiziológiás körülmények között csak kis számú eozinofil szabadul fel a csontvelőből. Az eozinofil termelés azonban drámaian megnövekszik az allergiás betegségekhez, például az asztmához kapcsolódó úgynevezett Th2-sejtes válaszok eredményeként (2-4). Arra is bizonyíték van, hogy az eozinofilek hozzájárulnak a homeosztatikus immunfolyamatokhoz (4, 5). Az eozinofil termelés növekedését a citokinek egy dedikált készlete, nevezetesen az IL-3, IL-5 és a granulocita makrofág-CSF (GM-CSF) okozza (2, 4). Ezek közül a Th2-asszociált citokin, az IL-5 a legspecifikusabb citokin az eozinofil vonalra, és felelős az elkötelezett csontvelői progenitorokból származó eozinofilek terjeszkedéséért, a vérbe jutásért és a szövetekbe való vándorlást követő túlélésért (2, 4, 6). A sérülés helyén az eozinofilek felszabadíthatják citotoxikus granulátum fehérjéit, valamint előre kialakított citokineket és lipid mediátorokat, ami súlyosbítja a gyulladást és a szövetkárosodást, ami különösen káros, ha a Th2 válasz allergének ellen irányul (2, 4).

Az eozinofilek keringésből való felszaporodása megköveteli, hogy a vér eozinofiljei aktiválódjanak, ami az aktivált endotéliumhoz tapad, és a fehérvérsejtek a kapillárisokból az őket körülvevő szövetekbe vándorolnak (extravazáció (7, 8)). Az eozinofilek leállását az erekben és a légutak falába, valamint a hörgőszöveten és a hámszöveten keresztül a légúti lumenbe történő extravazációját az integrineknek nevezett fehérjék csoportja közvetíti (7, 8). Az allergiás vagy asztmás betegek véreozinofiljei nagyobb fokú adhéziót vagy migrációt mutatnak, mint a normál önkéntesekből származó eozinofilek (9).

Farmakodinámiás biomarkerek a mepolizumab-kezelésre adott válaszhoz A mepolizumablizumab nagy specifitással és affinitással kötődik a humán IL-5-höz (10), a kulcsfontosságú T2 citokinhez, amely a vér és szöveti eozinofilek szabályozásáért felelős (11). A mepolizumab megakadályozza, hogy az IL-5 kötődjön az eozinofil sejtfelszínen expresszálódó IL-5 receptor komplexhez, és így gátolja az IL-5 jelátvitelt, gátolja az eozinofil túlélést és proliferációt. Bár az IL-5 inhibitorok pontos hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott, a kívánt cél az aktivált eozinofilek hatásának semlegesítése a vérben, a szövetekben és a tüdőben, különösen az asztmában a tüdőben a terápiás hatás elérése érdekében.

Asztmában 1990-ben összefüggést állapítottak meg az eozinofil túlzott expressziója és az asztma súlyossága között (12), és a későbbi tanulmányok azóta megismételték azt a nézetet, hogy a vér vagy a köpet eozinofilszáma felhasználható a súlyos eozinofil asztmában szenvedő résztvevők jellemzésére (13). A SIRIUS vizsgálatban kimutatták, hogy a 100 mg-os szubkután adagolt mepolizumab csökkenti a napi orális kortikoszteroidok szükségletét, ugyanakkor javítja az asztma kontrollját, a tüdőfunkciót és az életminőséget, valamint csökkenti az exacerbációkat (14). A MENSA vizsgálatban a mepolizumabbal kezelt résztvevők szignifikánsan csökkent exacerbációról és az asztma kontroll kérdőíves pontszámainak javulásáról számoltak be (15). A mepolizumab kutatók a vérben lévő eozinofileket azonosították, nem pedig a köpetben lévő eozinofileket, amelyek jó előrejelzője a mepolizumab klinikai hatékonyságának, hozzáférhető biomarkerként szolgálva a súlyos eozinofil asztmához. Ezenkívül a DREAM(17) és a MENSA(15) tanulmányok másodlagos elemzése(16) a mepolizumab klinikai hatékonyságát azonosította olyan súlyos asztmás betegeknél, akiknél a kiindulási eozinofilszám ≥150-300 sejt/µl és ≥300 sejt/µl.

Az eozinofilek alcsoportjai asztmában Egerekben az eozinofilek alcsoportjait azonosították (18): i) tüdőben élő eozinofilek (rEos), amelyek IL-5-től független, gyűrű alakú maggal rendelkező sejtek és ii) gyulladásos eozinofilek (iEos), amelyek szegmentált sejtmaggal rendelkező IL-5-függő sejtekként határozzák meg. Az asztma egérmodelljében Mesnil és munkatársai arról számoltak be, hogy a tüdő rEos jellemzői változatlanok maradtak, de az rEos-ok az iEos-okkal együtt lokalizálódnak a tüdőben, és hogy az rEos-t nem tartalmazó egerek Th2-sejt-válasza megnövekedett a belélegzett allergénekre. Az emberen végzett vizsgálatok arról számoltak be, hogy a nem asztmás emberi tüdőben talált parenchimális rEos-ok fenotípusosan különböznek az eozinofil asztmás betegek köpetéből izolált iE-ktől. Ezek az adatok rávilágítanak az eozinofilek jellegzetes keringési és tüdőrezidens alcsoportjaira az emberben.

Az eozinofilek sok olyan molekulát választanak ki, amelyek részt vesznek az asztma patológiájában, beleértve a citotoxikus granulátum alkotórészeit, a citokineket és kemokineket, például a lipid mediátorokat, a leukotriéneket (2, 19). Míg az IL-5 szerepe megerősített az eozinofil aktivációban és az asztmában, más citokinek, mint például a GM-CSF és az IL-3, amelyek szintén szerepet játszanak az asztmában, összehasonlító aktivitását még nem határozták meg teljesen. Az eotaxinokat (CCL11 és CCL24) fontos kemokinek tekintik, amelyek részt vesznek az eozinofilek légutakba való toborzásában, míg az IL-4 és IL-3 túlzottan expresszálódik a súlyos asztmás betegek légútjaiban (20, 21). A Th2-típusú citokinek mellett az IFN-ek és a TNFα is fokozzák az eozinofilek szabályozását, és meghosszabbítják túlélésüket (22, 23). Továbbá az aktivált eozinofileken jelenlévő TSLPR, IL33R és CCR3 receptorokról azt találták, hogy megemelkedtek súlyos eozinofil asztmában (24). Így az eozinofilek alcsoportjainak citokinstimulációjának, a stimulált eozinofilek és az ebből eredő differenciális mediátor-felszabadulás közötti lehetséges áthallás vizsgálata. A fehérje expressziója valószínűleg jobban megérti a súlyos asztmában szerepet játszó patofiziológiai jelátviteli útvonalakat.

Megfigyelési vizsgálat Ez egy megfigyeléses vizsgálat olyan résztvevők körében, akiknél súlyos asztmát diagnosztizáltak, és követik nyomon és kezelik a súlyos asztma kezelésére vonatkozó jóváhagyott brit irányelvek szerint. Ebben a csoportban a résztvevőket mepolizumabbal kezelték a vér eozinofilszámának megfelelően. Ezeket a résztvevőket az eozinofil molekuláris fenotípus szerint toborozzák és fenotipizálják a vér- és tüdőtranszkriptomika és proteomika elemzésével. A résztvevőket 0, 3 és 12 hónapos korban értékelik. A véletlenszerű klinikai leletet indokolt esetben továbbítják a klinikai csoportnak és a háziorvosnak.

A vizsgálat indoklása A keringő és a tüdőben élő eozinofilek alcsoportjai súlyos asztmában és az anti-IL-5 terápia hatékonysága közötti kapcsolatot nem vizsgálták.

Célkitűzések A keringésből és a légutakból, különösen a vérből és a szövetekből származó eozinofilek transzkriptomikus és mediátor profiljának meghatározása súlyos asztmában szenvedő betegeknél kezdetben és Mepolizumablizumab terápia alatt.

Vizsgálati modell Elfogulatlan vizsgálat a keringő és a tüdőben rezidens eozinofilek összes alcsoportjának azonosítására olyan biológiailag naiv résztvevőknél, akik súlyos asztmában szenvedtek a kiinduláskor és a mepolizumab-kezelést (anti-IL-5 Rx) követő időpontokban. A súlyos asztmás betegeket (Eos>300/ul) a Royal Brompton Hospital súlyos asztma klinikájáról veszik fel, és amennyire lehetséges, a résztvevők nem kapnak OCS-terápiát.

Elsődleges célok (i) Az egy időpontban súlyos asztmában szenvedő résztvevők keringő eozinofiljeinek fenotípus-alcsoportjai (ii) A keringő és tüdőeozinofilek fenotípus-alcsoportjai az egy éven keresztül Mepolizumab-kezelésben részesülő súlyos asztmában szenvedő résztvevőktől.

1. vizsgálat: A keringő eozinofilek fenotípusos alcsoportjai súlyos asztmában szenvedő résztvevőknél egy időpontban

Toborzás: 15 biológiailag naiv SA, aki nem részesül fenntartó OCS-ben, és 15 SA jelenleg Mepolizumab-terápiában részesül, jó klinikai válaszreakcióval.

Ezektől a résztvevőktől vérmintákat (90 ml) vesznek. Ezekből a mintákból véreozinofileket izolálnak, amelyeket ezután altípusba sorolnak (fenotípust) úgy, hogy egyidejűleg mérik a gén és a sejtfelszíni fehérje expresszióját ugyanabban a sejtben. A vér eozinofiljeit laboratóriumban is sejttenyésztjük, és különféle citokinekkel és kemokinekkel serkentik a gyulladásos mediátorok felszabadulását. Ez együttesen növeli az asztmás eozinofilek sejt heterogenitásának megértését, és azonosítja a különbséget a perifériás vér eozinofil populációi között a kezeletlen és a mepolizumablizumabbal kezelt résztvevőkben.

2. vizsgálat: A keringő és tüdő eozinofilek fenotípusos alcsoportjai súlyos asztmában szenvedő résztvevőktől, akik egy éven keresztül Mepolizumab-kezelésben részesültek.

Toborozzon 36 súlyos asztmás résztvevőt, akiknek megfelelően jellemezték a súlyos asztmás betegeket (Eos>300/ul), nem OCS fenntartó terápiában, hogy 30 résztvevőtől páros biopsziás mintát kapjanak.

Vérmintákat vesznek a kiinduláskor, 3 és 12 hónappal a mepolizumab-terápia után. A vér eozinofiljeit ezután izolálják és fenotipizálják úgy, hogy egyidejűleg mérik a gén és a sejtfelszíni fehérje expresszióját ugyanabban a sejtben. A vér eozinofiljeit laboratóriumban is sejttenyésztjük, és különféle citokinekkel és kemokinekkel serkentik a gyulladásos mediátorok felszabadulását. Ez együttesen javítani fogja az asztmás eozinofilek sejtheterogenitásának megértését a mepolizumab terápia után.

A bronchoszkópiát 36 résztvevőn végzik el, mintavétellel az endobronchiális tüdőbiopsziából a kiinduláskor és 1 évvel a mepolizumab-terápia után; a második eljárást az utolsó Mepolizumab injekciót követő 2 héten belül kell elvégezni. Egysejtes RNS-seq 10xGenomics és bulk -RNS -seq vizsgálatra kerül sor a Gronigen-csoport optimalizált protokollja alapján a tüdőszövet eozinofiljein a tüdőszövet enzimatikus disasszociációjával (4oC-on) a kiinduláskor és 1 évvel a Mepolizumab-terápia után. Immunhisztokémiát (IHC) is végeznek a sejtek tartalmának és szerkezetének jellemzésére. Négy biopsziát tartanak fenn az RNS-seq és kettőt az IHC számára.