Фенотипирование циркулирующих и резидентных эозинофилов в легких при тяжелой астме (P-CLESA) (P-CLESA)

Предыстория: тяжелая астма определяется как «астма, требующая лечения высокими дозами ингаляционных кортикостероидов (ICS) плюс второй контролирующий препарат (и/или системные кортикостероиды), чтобы предотвратить переход ее в «неконтролируемый» или которая остается «неконтролируемой», несмотря на эту терапию». (1), представляющий наиболее трудную для управления группу участников. Это гетерогенное состояние, и использование математических подходов привело к определению клинических подтипов (фенотипов) из когорт в Европе, США и Азии. С внедрением терапии моноклональными антителами, такими как антитела к IgE (омализумаб), антитела к интерлейкину (IL)-5/анти-IL5Rα (меполизумаб, реслизумаб и бенрализумаб) и анти-IL4Rα (дупилумаб), началась персонализированная медицина. поскольку эти методы лечения эффективны у пациентов с аллергией и/или у пациентов с астмой с повышенным количеством воспалительных клеток определенного типа, называемых эозинофилами (эозинофильная астма), соответственно. Внедрение этих целевых методов лечения помогло части участников с тяжелой астмой, особенно с эозинофильной тяжелой астмой, но дальнейший прогресс будет достигнут с лучшим пониманием всех движущих путей, лежащих в основе этих фенотипов.

Биология и функция эозинофилов Эозинофилы характеризуются наличием в их цитоплазме специфических вторичных гранул, содержащих токсичные катионные белки (2). Научные исследования биологии эозинофилов показывают, что эозинофилы функционируют по-разному, включая выработку цитокинов и развитие воспаления дыхательных путей. В физиологических условиях из костного мозга высвобождается лишь небольшое количество эозинофилов. Однако продукция эозинофилов резко увеличивается в результате так называемого Th2-клеточного ответа, связанного с аллергическими заболеваниями, такими как астма (2-4). Имеются также данные о том, что эозинофилы способствуют гомеостатическим иммунным процессам (4, 5). Это увеличение продукции эозинофилов обусловлено специальным набором цитокинов, а именно ИЛ-3, ИЛ-5 и гранулоцитарно-макрофагальным КСФ (ГМ-КСФ) (2, 4). Среди них Th2-ассоциированный цитокин IL-5 является наиболее специфичным цитокином для эозинофильной линии и отвечает за размножение эозинофилов из коммитированных клеток-предшественников костного мозга, их высвобождение в кровь и их выживание после миграции в ткани (2, 4, 6). В месте повреждения эозинофилы могут высвобождать свои белки цитотоксических гранул, а также предварительно сформированные цитокины и липидные медиаторы, вызывая обострение воспаления и повреждение тканей, что особенно вредно, когда ответы Th2 направлены против аллергенов (2, 4).

Рекрутирование эозинофилов из кровотока требует активации эозинофилов крови, что приводит к их прикреплению к активированному эндотелию и перемещению лейкоцитов из капилляров в окружающие их ткани (экстравазация (7, 8)). Арест эозинофилов в сосудах и их экстравазация в стенку дыхательных путей и через бронхиальную ткань и эпителий в просвет дыхательных путей опосредованы набором белков, называемых интегринами (7, 8). Эозинофилы крови у субъектов с аллергией или астмой имеют большую степень адгезии или миграции по сравнению с таковыми у здоровых добровольцев (9).

Фармакодинамические биомаркеры ответа на лечение меполизумабом Меполизумаблизумаб с высокой специфичностью и аффинностью связывается с ИЛ-5 человека (10), ключевым цитокином Т2, ответственным за регуляцию эозинофилов в крови и тканях (11). Меполизумаб предотвращает связывание ИЛ-5 с рецепторным комплексом ИЛ-5, экспрессируемым на поверхности клеток эозинофилов, и, таким образом, ингибирует передачу сигналов ИЛ-5, блокируя выживание и пролиферацию эозинофилов. Хотя точный механизм действия ингибиторов ИЛ-5 полностью не выяснен, желаемая цель состоит в том, чтобы нейтрализовать действие активированных эозинофилов в крови, тканях и легких, особенно в легких при астме, для достижения терапевтического эффекта.

При астме связь между сверхэкспрессией эозинофилов и тяжестью астмы была установлена ​​в 1990 г. (12), и последующие исследования с тех пор подтвердили точку зрения, согласно которой количество эозинофилов в крови или мокроте можно использовать для характеристики участников с тяжелой эозинофильной астмой (13). В исследовании SIRIUS было показано, что меполизумаб в дозе 100 мг при подкожном введении снижает потребность в ежедневных пероральных кортикостероидах, в то же время улучшая контроль над астмой, функцию легких и качество жизни, а также уменьшая частоту обострений (14). В исследовании MENSA участники, получавшие меполизумаб, сообщали о значительном снижении частоты обострений и улучшении показателей контроля астмы (15). Исследователи меполизумаба идентифицировали эозинофилы крови, а не эозинофилы мокроты, как хороший предиктор клинической эффективности меполизумаба, обеспечивая доступный биомаркер для тяжелой эозинофильной астмы. Более того, вторичный анализ(16) исследований DREAM(17) и MENSA(15) выявил клиническую эффективность меполизумаба у участников с тяжелой астмой с исходным уровнем эозинофилов ≥150-300 клеток/мкл и ≥300 клеток/мкл.

Подгруппы эозинофилов при астме У мышей были идентифицированы подгруппы эозинофилов (18): i) резидентные эозинофилы в легких (rEos), которые представляют собой IL-5-независимые клетки с кольцевидным ядром, и ii) воспалительные эозинофилы (iEos), которые были определяется как IL-5-зависимые клетки с сегментированным ядром. В мышиной модели астмы Mesnil и коллеги сообщили, что характеристики rEos в легких остались неизменными, но rEos были локализованы совместно с iEos в легких, и что мыши, лишенные rEos, имели повышенный ответ клеток Th2 на вдыхаемые аллергены. Исследования на людях показали, что паренхиматозные rEos, обнаруженные в легких человека, не страдающего астмой, фенотипически отличались от rEos, выделенных из мокроты пациентов с эозинофильной астмой. Эти данные подчеркивают существование отличительных субпопуляций эозинофилов, находящихся в кровообращении и легких, у человека.

Эозинофилы секретируют многие молекулы, участвующие в патологии астмы, в том числе составляющие цитотоксические гранулы цитокины и хемокины, такие как липидные медиаторы лейкотриены (2, 19). В то время как роль IL-5 подтверждена в активации эозинофилов и астме, сравнительная активность других цитокинов, таких как GM-CSF и IL-3, также связанных с астмой, еще предстоит полностью определить. Эотаксины (CCL11 и CCL24) считаются важными хемокинами, участвующими в привлечении эозинофилов в дыхательные пути, в то время как IL-4 и IL-3, как сообщается, сверхэкспрессируются в дыхательных путях тяжелых астматиков (20, 21). В дополнение к этим цитокинам Th2-типа IFNs и TNFα также активируют эозинофилы и продлевают их выживание (22, 23). Кроме того, было обнаружено, что рецепторы TSLPR, IL33R и CCR3, присутствующие на активированных эозинофилах, повышены при тяжелой эозинофильной астме (24). экспрессия белка, вероятно, обеспечит лучшее понимание лежащих в основе патофизиологических сигнальных путей, вовлеченных в тяжелую астму.

Обсервационное исследование Это будет обсервационное исследование участников с диагнозом тяжелая астма, за которыми ведется наблюдение и лечение в соответствии с согласованными британскими рекомендациями по ведению тяжелой астмы. В этой группе участников будут лечить меполизумабом в соответствии с количеством эозинофилов в крови. Эти участники будут набраны и фенотипированы в соответствии с эозинофильным молекулярным фенотипом путем анализа транскриптомики и протеомики крови и легких. Участники будут оцениваться в возрасте 0, 3 и 12 месяцев. Случайные клинические данные будут переданы клинической бригаде и врачу общей практики, если это необходимо.

Обоснование исследования Взаимосвязь между подмножествами циркулирующих и резидентных эозинофилов в легких при тяжелой астме и эффективностью анти-ИЛ-5-терапии не изучалась.

Цели. Определить транскриптомные и медиаторные профили эозинофилов из кровотока и дыхательных путей, особенно резидентных в крови и тканях, у участников с тяжелой астмой в начале исследования и на терапии меполизумаблизумабом.

Модель исследования Непредвзятое исследование для выявления всех подмножеств циркулирующих эозинофилов и резидентных эозинофилов в легких у участников, ранее не подвергавшихся биологическому лечению, с тяжелой астмой на исходном уровне и в моменты времени после лечения меполизумабом (анти-ИЛ-5 Rx). Участники с тяжелой астмой (Eos>300/мкл) будут набраны из клиники тяжелой астмы в Королевской больнице Бромптона, и, насколько это возможно, участники не будут получать терапию ОКС.

Основные цели (i) Подмножества фенотипов циркулирующих эозинофилов у участников с тяжелой астмой в один момент времени (ii) Подмножества фенотипов циркулирующих и легочных эозинофилов у участников с тяжелой астмой, получавших меполизумаб в течение одного года.

Исследование 1: Подмножества фенотипов циркулирующих эозинофилов у участников с тяжелой астмой в один момент времени

Набрано: 15 биологически наивных СА, не получающих поддерживающую терапию ОКС, и 15 СА, получающих в настоящее время терапию меполизумабом, с хорошим клиническим ответом.

У этих участников будут взяты образцы крови (90 мл). Из этих образцов будут выделены эозинофилы крови, которые затем будут разделены на подтипы (фенотип) путем одновременного измерения экспрессии генов и белков клеточной поверхности в одной и той же клетке. Эозинофилы крови также будут культивироваться в лаборатории и стимулироваться различными цитокинами и хемокинами для определения высвобождения медиаторов воспаления. Вместе это улучшит наше понимание клеточной гетерогенности астматических эозинофилов и определит разницу между популяциями эозинофилов периферической крови у участников, не получавших лечения, и участников, получавших меполизумаблизумаб.

Исследование 2: Подмножества фенотипов циркулирующих и легочных эозинофилов у участников с тяжелой астмой, получавших меполизумаб в течение одного года.

Набрать 36 участников с тяжелой астмой, соответствующим образом охарактеризованных больных с тяжелой астмой (Eos>300/мкл), не получающих поддерживающую терапию OCS, для получения парных образцов биопсии от 30 участников.

Образцы крови будут взяты на исходном уровне, через 3 и 12 месяцев после терапии меполизумабом. Затем эозинофилы крови будут выделены и фенотипированы путем одновременного измерения экспрессии генов и белков клеточной поверхности в одной и той же клетке. Эозинофилы крови также будут культивироваться в лаборатории и стимулироваться различными цитокинами и хемокинами для определения высвобождения медиаторов воспаления. Вместе это улучшит наше понимание клеточной гетерогенности астматических эозинофилов после терапии меполизумабом.

Бронхоскопия будет выполнена у 36 участников, взятие биопсии эндобронхиального легкого в начале исследования и через 1 год после терапии меполизумабом; вторая процедура будет выполнена в течение 2 недель после последней инъекции меполизумаба. Одноклеточная РНК-seq 10xGenomics и массовая -RNA-seq будут выполняться с использованием оптимизированного протокола группы Gronigen на эозинофилах легочной ткани посредством ферментативной диссоциации легочной ткани (при 4oC) в начале исследования и через 1 год после терапии меполизумабом. Иммуногистохимия (ИГХ) также будет проводиться для характеристики клеточного состава и структуры. Четыре биопсии будут зарезервированы для секвенирования РНК и две для IHC.