Fenotypizace cirkulujících a plicních rezidentních eozinofilů u těžkého astmatu (P-CLESA) (P-CLESA)

Pozadí: Těžké astma bylo definováno jako „astma, které vyžaduje léčbu vysokými dávkami inhalačních kortikosteroidů (ICS) plus druhý kontrolér (a/nebo systémové kortikosteroidy), aby se zabránilo tomu, že se stane „nekontrolovaným“ nebo které zůstane „nekontrolované“ navzdory této léčbě“ (1), což představuje nejobtížněji ovladatelnou skupinu účastníků. Jde o heterogenní stav a využití matematických přístupů vedlo k definici klinických subtypů (fenotypů) z kohort v Evropě, USA a Asii. Se zavedením terapií monoklonálními protilátkami, jako je anti-IgE protilátka (omalizumab), anti-Interleukin (IL)-5/anti-IL5Rα protilátka (Mepolizumab, reslizumab a benralizumab) a anti-IL4Rα (dupilumab), byla zahájena personalizovaná medicína protože tyto terapie jsou účinné u pacientů s alergií a/nebo u pacientů s astmatem se zvýšeným počtem určitého typu zánětlivých buněk nazývaných eozinofily (eozinofilní astma). Zavedení těchto cílených terapií pomohlo části účastníků s těžkým astmatem, zejména těm s eozinofilním těžkým astmatem, ale další pokrok přijde s lepším pochopením všech hnacích cest, které jsou základem těchto fenotypů.

Biologie a funkce eozinofilů Eosinofily jsou charakterizovány přítomností specifických sekundárních granulí, v jejich cytoplazmě, obsahujících toxické kationtové proteiny(2). Výzkumné studie biologie eozinofilů ukazují, že eozinofily fungují mnoha způsoby, včetně produkce cytokinů a rozvoje zánětu dýchacích cest. Za fyziologických podmínek se z kostní dřeně uvolňuje pouze malé množství eozinofilů. Produkce eozinofilů se však dramaticky zvyšuje v důsledku takzvaných reakcí Th2 buněk spojených s alergickými onemocněními, jako je astma (2-4). Existují také důkazy, že eozinofily přispívají k homeostatickým imunitním procesům (4, 5). Toto zvýšení produkce eozinofilů je řízeno vyhrazenou sadou cytokinů, jmenovitě IL-3, IL-5 a granulocytární makrofágový CSF (GM-CSF) (2, 4). Mezi nimi je Th2-asociovaný cytokin IL-5 nejspecifičtějším cytokinem pro eosinofilní linii a je zodpovědný za expanzi eozinofilů ze zapojených progenitorů kostní dřeně, jejich uvolňování do krve a jejich přežití po migraci do tkání (2, 4, 6). V místě poranění mohou eozinofily uvolňovat své cytotoxické granulované proteiny, stejně jako předem vytvořené cytokiny a lipidové mediátory, k exacerbaci zánětu a poškození tkáně, což je zvláště škodlivé, když jsou Th2 reakce namířeny proti alergenům (2, 4).

Získávání eozinofilů z oběhu vyžaduje aktivaci krevních eozinofilů, což vede k jejich připojení k aktivovanému endotelu a pohybu bílých krvinek z kapilár do tkání, které je obklopují (extravasace(7, 8)). Zástava eozinofilů v cévách a jejich extravazace do stěny dýchacích cest a přes bronchiální tkáň a epitel do lumen dýchacích cest zprostředkovává soubor proteinů zvaných integriny(7, 8). Krevní eozinofily od subjektů s alergií nebo astmatem mají vyšší stupeň adheze nebo migrace ve srovnání s těmi od normálních dobrovolníků (9).

Farmakodynamické biomarkery odpovědi na léčbu mepolizumabem Mepolizumablisum se váže s vysokou specificitou a afinitou na lidský IL-5(10), klíčový T2 cytokin zodpovědný za regulaci krevních a tkáňových eozinofilů(11). Mepolizumab brání IL-5 ve vazbě na IL-5 receptorový komplex exprimovaný na povrchu eozinofilních buněk, a tak inhibuje signalizaci IL-5, blokuje přežití a proliferaci eozinofilů. I když přesný mechanismus účinku inhibitorů IL-5 není zcela objasněn, požadovaným cílem je neutralizovat účinek aktivovaných eozinofilů v krvi, tkáních a plicích, zejména plic pro astma, aby bylo dosaženo terapeutického účinku.

U astmatu byla v roce 1990 zjištěna souvislost mezi nadměrnou expresí eozinofilů a závažností astmatu (12) a následné studie od té doby opakovaly názor, že k charakterizaci účastníků s těžkým eozinofilním astmatem lze použít počty eozinofilů v krvi nebo ve sputu (13). Ve studii SIRIUS bylo prokázáno, že mepolizumab v dávce 100 mg podávaný subkutánně snižuje potřebu denních perorálních kortikosteroidů a současně zlepšuje kontrolu astmatu, plicní funkce a kvalitu života a snižuje počet exacerbací (14). Účastníci studie MENSA léčení mepolizumabem uváděli signifikantní snížení exacerbací a zlepšení skóre v dotazníku kontroly astmatu(15). Vyšetřovatelé mepolizumabu identifikovali spíše krevní eozinofily než eozinofily ve sputu jako dobrý prediktor klinické účinnosti mepolizumabu, který poskytuje dostupný biomarker těžkého eozinofilního astmatu. Kromě toho sekundární analýza(16) studií DREAM(17) a MENSA(15) identifikovala klinickou účinnost mepolizumabu u účastníků těžkého astmatu s výchozím počtem eozinofilů ≥150-300 buněk/µl a ≥300 buněk/µl.

Podskupiny eozinofilů u astmatu U myší byly identifikovány podskupiny eozinofilů(18): i) plicní rezidentní eozinofily (rEos), což jsou buňky nezávislé na IL-5 s prstencovým jádrem, a ii) zánětlivé eozinofily (iEos), které byly definované jako IL-5-dependentní buňky se segmentovaným jádrem. Na myším modelu astmatu Mesnil a kolegové uvedli, že rysy plicního rEos zůstaly nezměněny, ale rEos byly lokalizovány společně s iEos v plicích a že myši bez rEos měly zvýšenou odpověď Th2 buněk na inhalované alergeny. Studie u člověka uvádějí, že parenchymální rEos nalezené v neastmatických lidských plicích byly fenotypově odlišné od iEos izolovaných ze sputa eozinofilních astmatických pacientů. Tyto údaje zdůrazňují existenci charakteristických podskupin eozinofilů, které se nacházejí v oběhu a plicích u člověka.

Eozinofily vylučují mnoho molekul, které se podílejí na patologii astmatu, včetně cytotoxických složek granulí, cytokinů a chemokinů, jako jsou lipidové mediátory leukotrieny (2, 19). Zatímco úloha IL-5 je potvrzena v aktivaci eozinofilů a astmatu, komparativní aktivity jiných cytokinů, jako je GM-CSF a IL-3, které se také podílejí na astmatu, musí být ještě plně stanoveny. Eotaxiny (CCL11 a CCL24) jsou považovány za důležité chemokiny podílející se na náboru eozinofilů do dýchacích cest, zatímco IL-4 a IL-3 jsou hlášeny jako nadměrně exprimované v dýchacích cestách těžkých astmatiků(20, 21). Kromě těchto cytokinů typu Th2 také IFN a TNFα upregulují eozinofily a prodlužují jejich přežití(22, 23). Dále bylo zjištěno, že receptory TSLPR, IL33R a CCR3 přítomné na aktivovaných eozinofilech jsou zvýšené u těžkého eozinofilního astmatu (24). Výzkum cytokinové stimulace podskupin eozinofilů, možného přeslechu mezi stimulovanými eozinofily a výsledného rozdílného uvolňování mediátorů a proteinová exprese pravděpodobně poskytne lepší porozumění základním patofyziologickým signálním drahám zapojeným do těžkého astmatu.

Observační studie Půjde o observační studii účastníků s diagnózou těžkého astmatu, kteří jsou sledováni a řízeni podle schválených doporučení Spojeného království pro léčbu těžkého astmatu. V této skupině budou účastníci léčeni mepolizumabem podle počtu eozinofilů v krvi. Tito účastníci budou rekrutováni a fenotypováni podle eozinofilního molekulárního fenotypu analýzou krevní a plicní transkriptomiky a proteomiky. Účastníci budou hodnoceni v 0, 3 a 12 měsících. Náhodný klinický nález bude předán klinickému týmu a praktickému lékaři, jak je odůvodněné.

Odůvodnění studie Vztah mezi podskupinami cirkulujících a plicních eozinofilů u těžkého astmatu a účinností anti-IL-5 terapie nebyl zkoumán.

Cíle Stanovit transkriptomické a mediátorové profily eozinofilů z cirkulace a dýchacích cest, konkrétně rezidentů krve a tkáně, u účastníků s těžkým astmatem na začátku léčby a na léčbě mepolizumablisumabem.

Studijní model Nezaujatá studie k identifikaci všech podskupin cirkulujících a plicních rezidentních eozinofilů u biologických naivních účastníků s těžkým astmatem na začátku léčby a v časových bodech po léčbě mepolizumabem (anti-IL-5 Rx). Účastníci s těžkým astmatem (Eos>300/ul) budou přijati z kliniky pro těžké astma v Royal Brompton Hospital a pokud to bude možné, účastníci nebudou na terapii OCS.

Primární cíle (i) Fenotypové podskupiny cirkulujících eozinofilů od účastníků s těžkým astmatem v jednom časovém bodě (ii) Fenotypové podskupiny cirkulujících a plicních eozinofilů od účastníků s těžkým astmatem na léčbě mepolizumabem po dobu jednoho roku.

Studie 1: Fenotypové podskupiny cirkulujících eozinofilů u účastníků s těžkým astmatem v jednom časovém bodě

Nábor: 15 biologických naivních SA ne na udržovací OCS a 15 SA v současné době na terapii mepolizumabem s dobrou klinickou odpovědí.

Těmto účastníkům budou odebrány vzorky krve (90 ml). Z těchto vzorků budou izolovány krevní eozinofily, které pak budou rozděleny do subtypů (fenotyp) současným měřením exprese genu a proteinu buněčného povrchu ve stejné buňce. Krevní eozinofily budou také kultivovány v laboratoři a stimulovány řadou cytokinů a chemokinů, aby se určilo uvolňování zánětlivých mediátorů. Společně to zvýší naše chápání buněčné heterogenity u astmatických eozinofilů a identifikuje rozdíl mezi populacemi eozinofilů v periferní krvi u neléčených účastníků a účastníků léčených mepolizumablisumabem.

Studie 2: Fenotypové podskupiny cirkulujících a plicních eozinofilů od účastníků s těžkým astmatem na léčbě mepolizumabem po dobu jednoho roku.

Přijměte 36 účastníků s těžkým astmatem, kteří náležitě charakterizovali těžké astmatiky (Eos> 300/ul), kteří nejsou na udržovací léčbě OCS, abyste získali párové vzorky biopsie od 30 účastníků

Vzorky krve budou odebrány na začátku, 3 a 12 měsíců po terapii mepolizumabem. Krevní eozinofily pak budou izolovány a fenotypizovány současným měřením exprese genu a proteinu buněčného povrchu ve stejné buňce. Krevní eozinofily budou také kultivovány v laboratoři a stimulovány řadou cytokinů a chemokinů, aby se určilo uvolňování zánětlivých mediátorů. Společně to zvýší naše chápání buněčné heterogenity u astmatických eozinofilů po terapii mepolizumabem.

Bronchoskopie bude provedena u 36 účastníků, odběr vzorků endobronchiální plicní biopsie na začátku a 1 rok po terapii mepolizumabem; druhý postup bude proveden do 2 týdnů od poslední injekce mepolizumabu. Jednobuněčná RNA-seq 10xGenomics a bulk -RNA -seq budou prováděny s použitím optimalizovaného protokolu skupiny Gronigen na eozinofilech plicní tkáně prostřednictvím enzymatické disociace plicní tkáně (při 4 °C) na začátku a 1 rok po léčbě mepolizumabem. Imunohistochemie (IHC) bude také provedena k charakterizaci buněčného obsahu a struktury. Čtyři biopsie budou rezervovány pro RNA-seq a dvě pro IHC.