Fenotipado de eosinófilos circulantes y residentes en los pulmones en asma grave (P-CLESA) (P-CLESA)

Antecedentes: el asma grave se ha definido como "el asma que requiere tratamiento con dosis altas de corticosteroides inhalados (ICS) más un segundo controlador (y/o corticosteroides sistémicos) para evitar que se 'descontrole' o que permanezca 'descontrolado' a pesar de esta terapia". (1), que representa un grupo de participantes muy difícil de manejar. Es una condición heterogénea y el uso de enfoques matemáticos condujo a la definición de subtipos clínicos (fenotipos) de cohortes en Europa, EE. UU. y Asia. Con la introducción de terapias con anticuerpos monoclonales como el anticuerpo anti-IgE (omalizumab), el anticuerpo anti-interleucina (IL)-5/anti-IL5Rα (Mepolizumab, reslizumab y benralizumab) y el anti-IL4Rα (dupilumab), se ha iniciado la medicina personalizada. ya que estas terapias son efectivas en pacientes alérgicos y/o asmáticos con un mayor número de un tipo particular de células inflamatorias llamadas eosinófilos (asma eosinofílica), respectivamente. La introducción de estas terapias dirigidas ha ayudado a una proporción de participantes con asma grave, en particular a aquellos con asma grave eosinofílica, pero se logrará un mayor progreso con una mejor comprensión de todas las vías impulsoras que subyacen a estos fenotipos.

La biología y función de los Eosinófilos Los eosinófilos se caracterizan por la presencia de gránulos secundarios específicos, en su citoplasma, que contienen proteínas catiónicas tóxicas(2). Los estudios de investigación sobre la biología de los eosinófilos indican que los eosinófilos funcionan de muchas maneras, incluida la producción de citocinas y el desarrollo de la inflamación de las vías respiratorias. En condiciones fisiológicas, solo se libera una pequeña cantidad de eosinófilos de la médula ósea. Sin embargo, la producción de eosinófilos aumenta drásticamente como resultado de las llamadas respuestas de células Th2 asociadas con enfermedades alérgicas como el asma (2-4). También hay evidencia de que los eosinófilos contribuyen a los procesos inmunológicos homeostáticos (4, 5). Este aumento en la producción de eosinófilos está impulsado por un conjunto específico de citocinas, a saber, IL-3, IL-5 y granulocitos macrófagos-CSF (GM-CSF) (2, 4). Entre estos, la citocina IL-5 asociada a Th2 es la citocina más específica para el linaje de los eosinófilos y es responsable de la expansión de los eosinófilos de los progenitores de la médula ósea comprometidos, su liberación en la sangre y su supervivencia después de la migración a los tejidos (2, 4, 6). En el sitio de la lesión, los eosinófilos pueden liberar sus proteínas granulares citotóxicas, así como citocinas preformadas y mediadores lipídicos, lo que exacerba la inflamación y el daño tisular, lo que es particularmente perjudicial cuando las respuestas Th2 se dirigen contra los alérgenos (2, 4).

El reclutamiento de eosinófilos de la circulación requiere que los eosinófilos de la sangre se activen, lo que lleva a su unión al endotelio activado y al movimiento de glóbulos blancos desde los capilares a los tejidos que los rodean (extravasación(7, 8)). La detención de eosinófilos en los vasos y su extravasación en la pared de las vías respiratorias ya través del tejido bronquial y el epitelio hasta la luz de las vías respiratorias está mediada por un conjunto de proteínas denominadas integrinas (7, 8). Los eosinófilos en sangre de sujetos con alergia o asma tienen un mayor grado de adhesión o migración en comparación con los de voluntarios normales (9).

Biomarcadores farmacodinámicos para la respuesta al tratamiento con mepolizumab Mepolizumablizumab se une con alta especificidad y afinidad a la IL-5 humana(10), la citocina T2 clave responsable de la regulación de los eosinófilos en sangre y tejidos(11). Mepolizumab evita que la IL-5 se una al complejo del receptor de IL-5 expresado en la superficie celular de los eosinófilos y, por lo tanto, inhibe la señalización de la IL-5, bloqueando la supervivencia y proliferación de los eosinófilos. Aunque el mecanismo de acción exacto de los inhibidores de IL-5 no está completamente dilucidado, el objetivo deseado es neutralizar el efecto de los eosinófilos activados en sangre y tejidos y pulmón, particularmente el pulmón para el asma para lograr un efecto terapéutico.

En el asma, se estableció una asociación entre la sobreexpresión de eosinófilos y la gravedad del asma en 1990(12) y, desde entonces, estudios posteriores han repetido la opinión de que los recuentos de eosinófilos en sangre o esputo pueden utilizarse para caracterizar a los participantes con asma eosinofílica grave (13). En el ensayo SIRIUS, se demostró que mepolizumab en una dosis de 100 mg administrados por vía subcutánea reduce el requerimiento de corticosteroides orales diarios y, al mismo tiempo, mejora el control del asma, la función pulmonar y la calidad de vida y reduce las exacerbaciones(14). En el ensayo MENSA, los participantes tratados con mepolizumab informaron exacerbaciones significativamente reducidas y una mejora en las puntuaciones del cuestionario de control del asma(15). Los investigadores de Mepolizumab identificaron los eosinófilos en sangre, en lugar de los eosinófilos en esputo, como un buen predictor de la eficacia clínica de Mepolizumab, proporcionando un biomarcador accesible para el asma eosinofílica grave. Además, el análisis secundario(16) de los estudios DREAM(17) y MENSA(15) identificó la eficacia clínica de mepolizumab en participantes con asma grave con recuentos de eosinófilos basales de ≥150-300 células/µl y ≥300 células/µl.

Subconjuntos de eosinófilos en el asma En ratones se han identificado subconjuntos de eosinófilos(18): i) eosinófilos residentes en los pulmones (rEos) que son células independientes de IL-5 con un núcleo en forma de anillo y ii) eosinófilos inflamatorios (iEos), que fueron definidas como células dependientes de IL-5 con un núcleo segmentado. En un modelo murino de asma, Mesnil y sus colegas informaron que las características de rEos pulmonar permanecieron sin cambios, pero rEos se co-localizó con iEos en el pulmón y que los ratones que carecían de rEos tenían una mayor respuesta de células Th2 a los alérgenos inhalados. Los estudios en humanos informaron que la Eos parenquimatosa encontrada en pulmones humanos no asmáticos era fenotípicamente distinta de la Eos aislada del esputo de pacientes asmáticos eosinofílicos. Estos datos resaltan la existencia de subconjuntos distintivos de eosinófilos circulatorios y residentes en los pulmones en el hombre.

Los eosinófilos secretan muchas moléculas implicadas en la patología del asma, incluidas las citocinas y quimiocinas constituyentes de los gránulos citotóxicos, como los mediadores de lípidos, los leucotrienos (2, 19). Si bien el papel de la IL-5 está confirmado en la activación de los eosinófilos y el asma, las actividades comparativas de otras citoquinas como GM-CSF e IL-3, también implicadas en el asma, aún no se han determinado por completo. Las eotaxinas (CCL11 y CCL24) se consideran quimiocinas importantes involucradas en el reclutamiento de eosinófilos en las vías respiratorias, mientras que se informa que IL-4 e IL-3 se sobreexpresan en las vías respiratorias de los asmáticos graves (20, 21). Además de estas citocinas de tipo Th2, los IFN y el TNFα también aumentan los eosinófilos y prolongan su supervivencia (22, 23). Además, se encontró que los receptores TSLPR, IL33R y CCR3 presentes en los eosinófilos activados estaban elevados en el asma eosinofílica grave (24). Es probable que la expresión de proteínas proporcione una mejor comprensión de las vías de señalización fisiopatológicas subyacentes implicadas en el asma grave.

Estudio observacional Este será un estudio observacional de participantes diagnosticados con asma grave que serán objeto de seguimiento y tratamiento de acuerdo con las directrices acordadas del Reino Unido para el tratamiento del asma grave. En este grupo, los participantes habrán sido tratados con Mepolizumab según el recuento de eosinófilos en sangre. Estos participantes serán reclutados y fenotipados de acuerdo con el fenotipo molecular eosinofílico mediante análisis de transcriptómica y proteómica de sangre y pulmón. Los participantes serán evaluados a los 0, 3 y 12 meses. Los hallazgos clínicos incidentales se enviarán al equipo clínico y al médico de cabecera, según se justifique.

Justificación del estudio No se ha explorado la relación entre los subconjuntos de eosinófilos circulantes y residentes en los pulmones en el asma grave y la eficacia de la terapia anti-IL-5.

Objetivos Determinar los perfiles transcriptómicos y mediadores de los eosinófilos de la circulación y las vías respiratorias, específicamente residentes en sangre y tejidos, en participantes con asma grave al inicio del estudio y en tratamiento con mepolizumablizumab.

Modelo de estudio Estudio imparcial para identificar todos los subconjuntos de eosinófilos circulantes y residentes en los pulmones en participantes sin tratamiento previo biológico con asma grave al inicio y en momentos posteriores al tratamiento con Mepolizumab (anti-IL-5 Rx). Los participantes con asma grave (Eos>300/ul) se reclutarán en la clínica de asma grave del Royal Brompton Hospital y, en la medida de lo posible, los participantes no recibirán terapia OCS.

Objetivos primarios (i) Subconjuntos de fenotipos de eosinófilos circulantes de participantes con asma grave en un punto temporal (ii) Subconjuntos de fenotipos de eosinófilos circulantes y pulmonares de participantes con asma grave en tratamiento con mepolizumab durante un año.

Estudio 1: subconjuntos de fenotipos de eosinófilos circulantes en participantes con asma grave en un punto temporal

Reclutar: 15 SA sin tratamiento biológico no tratados previamente con OCS de mantenimiento y 15 SA actualmente en tratamiento con mepolizumab con buena respuesta clínica.

Se tomarán muestras de sangre (90 ml) de estos participantes. Los eosinófilos de la sangre se aislarán de estas muestras que luego se subtipificarán (fenotipo) midiendo simultáneamente la expresión de proteínas de superficie celular y génica en la misma célula. Los eosinófilos sanguíneos también se cultivarán en el laboratorio y se estimularán con una variedad de citocinas y quimiocinas para determinar la liberación de mediadores inflamatorios. Juntos, esto aumentará nuestra comprensión de la heterogeneidad celular en los eosinófilos asmáticos e identificará la diferencia entre las poblaciones de eosinófilos en sangre periférica en participantes no tratados y tratados con Mepolizumablizumab.

Estudio 2: subconjuntos de fenotipos de eosinófilos circulantes y pulmonares de participantes con asma grave en tratamiento con mepolizumab durante un año.

Reclute a 36 participantes con asma grave adecuadamente caracterizados asmáticos graves (Eos>300/ul), que no estén en terapia de mantenimiento con OCS, para lograr muestras de biopsia pareadas de 30 participantes

Se tomarán muestras de sangre al inicio, 3 y 12 meses después de la terapia con mepolizumab. A continuación, los eosinófilos de la sangre se aislarán y se caracterizarán mediante la medición simultánea de la expresión de la proteína de la superficie celular y del gen en la misma célula. Los eosinófilos sanguíneos también se cultivarán en el laboratorio y se estimularán con una variedad de citocinas y quimiocinas para determinar la liberación de mediadores inflamatorios. Juntos, esto aumentará nuestra comprensión de la heterogeneidad celular en los eosinófilos asmáticos después de la terapia con mepolizumab.

Se realizará una broncoscopia en 36 participantes, tomando muestras de una biopsia pulmonar endobronquial al inicio y 1 año después de la terapia con mepolizumab; el segundo procedimiento se realizará dentro de las 2 semanas posteriores a la última inyección de mepolizumab. Se realizarán RNA-seq 10xGenomics de una sola célula y bulk -RNA -seq, utilizando el protocolo optimizado del grupo Gronigen, en eosinófilos de tejido pulmonar a través de la disociación enzimática del tejido pulmonar (a 4oC) al inicio y 1 año después de la terapia con mepolizumab. También se realizará inmunohistoquímica (IHC) para caracterizar el contenido y la estructura celular. Se reservarán cuatro biopsias para RNA-seq y dos para IHC.