화상 상처 마이크로바이옴 이해: 전통적인 상처 문화와 차세대 시퀀싱 기술 비교

1. - INTRODUCTION: 인간 마이크로바이옴은 박테리아, 곰팡이, 고세균 및 바이러스를 포함한 미생물로 구성되어 있으며 신체와 관련하여 살고 있습니다. 보통 사람의 경우 박테리아만 해도 숙주 세포보다 10배 더 많고 인간 게놈보다 1000개 더 많은 유전자를 포함하고 있습니다. 따라서 신체 바이오매스의 3% 미만으로 구성되어 있음에도 불구하고 인간 마이크로바이옴은 건강과 발달의 복잡한 생체역학을 확립하고 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 지난 20년 동안 NIH Human Microbiome Project는 마이크로바이옴이 인간 생리학에 미치는 새로 발견된 여러 가지 영향에 주목했습니다(Turnbaugh et al., 2007). 지난 20년 동안 놀라운 발전이 이루어졌음에도 불구하고 피부 상처에 존재하는 다양한 미생물 생태계와 숙주 재생, 면역 반응 및 상처 치유에 미치는 영향은 최근에야 해독되기 시작했습니다. 지금까지 우리는 화상 상처 마이크로바이옴과 감염, 전신 염증, 상처 치유 및 궁극적으로 환자 예후에 미치는 영향에 대해 피상적으로만 이해했습니다.

2. - 배경: 심한 화상은 이환율과 사망률의 주요 글로벌 원인입니다. National Center for Injury Prevention and Control과 American Burn Association에 따르면 미국에서만 매년 450,000명의 환자가 열 화상을 입습니다. 치료를 위해 입원한 환자 중 3%는 주로 감염과 패혈증으로 인해 생존하지 못할 것입니다. 심한 화상 후, 화상 상처에서 미생물 집락 형성 패턴은 그람 양성 박테리아로 시작하여 그 다음 그람 음성 박테리아, 그 다음으로 더 악성인 병원균으로 이어지는 상대적으로 예측 가능한 보충 순서를 따릅니다. 여러 연구에서 입원 기간이 화상 상처에서 분리된 미생물 종과 관련이 있음을 보여주었습니다. 많은 연구에서 만성 피부 상처의 미생물 군집을 조사하여 치유가 병리학적 및 유익한 미생물 집단 모두에 의해 영향을 받는다는 결과를 제시했습니다. 전통적인 미생물학 배양 분석은 실제 상처 미생물군의 대용물이지만 많은 종들이 표준 조건에서 배양하기 어렵고 배양 환경 자체가 상처 환경과 크게 다르기 때문에 화상 상처에 존재하는 미생물 생태계의 전체 호흡을 식별하지 못합니다. 또한, 상처 미생물 군집은 역동적이며 환경 요인, 상처 치료제, 숙주 면역 반응 및 약물에 의해 영향을 받아 변화합니다. 또한, 전통적인 상처 배양은 완료하는 데 며칠이 걸리며 그러한 시간이 지나면 상처 자체의 현재 미생물 거주자를 더 이상 반영하지 않을 수 있습니다. 마지막으로 알려진 병원성 종과 다제내성 균주(Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, carbapenem-resistant Enterobacteriaceae)에 많은 관심이 집중되고 있지만 유익한 종의 존재와 영향은 종종 간과됩니다.

   16S 및 18S amplicon 시퀀싱 및 metagenome shotgun 시퀀싱과 같은 차세대 시퀀싱(NGS) 기술을 사용하는 문화 독립적인 방법은 기존 미생물 배양보다 빠르고 민감한 것으로 입증되었습니다. 16S NGS 기술은 16S rDNA를 활용하여 원핵생물의 리보솜 rRNA 서열을 암호화합니다. 9개의 가변 영역이 16S rDNA 서열 내에 존재하며, 이는 박테리아 종 간의 유전적 차이를 표적으로 합니다. 유사한 방식으로 18S NGS 기술은 진핵생물의 리보솜 rRNA 서열을 인코딩하고 가변 영역은 시료 내 진핵생물 미생물 간의 종 차이를 분류하는 데 사용됩니다.

3. - 연구 절차 표본 및 데이터 수집: Burn Wound Data/Bio-Repository는 절제된 화상 조직에서 수술 팀이 폐기할 생체 표본을 수집합니다. 개별 수술 케이스에서 2개 이상의 전구 표본을 수집하지 않습니다. 각 표본은 수집 시 각각 무게가 약 0.5-2g인 두 개의 하위 표본으로 나뉩니다. 각 표본은 상지(팔 또는 손), 하지(다리 또는 발), 전방 흉부, 후방 흉부 또는 머리/목으로 분류된 특정 신체 부위에서만 채취해야 합니다. 또한 검체 오염의 위험이 높기 때문에 생식기 또는 회음부에서 검체를 채취하지 않습니다.

부표본은 얼음 위에 즉시 운반되어 -20ºC 냉동고에 임시로 보관된 다음 조직의 일부(0.5cm 미만)가 순서대로 RNAlater(R) RNA 안정화 솔루션(RNAlater(R))에 배치됩니다. 뉴클레오티드 보존/안정화를 위해. RNAlater(R)에 배치된 조직은 충분한 조직 침투를 허용하기 위해 밤새 4ºC에서 냉장 보관됩니다. 이후 보존된 표본은 -20ºC ~ -80ºC에서 보관됩니다. 이 과정은 수집 후 1시간 이내에 수행됩니다. 각 하위 표본은 RNAlater(R)에 배치할 두 개의 추가 표본을 생성합니다. 초기 냉장 기간 후 RNAlater(R) 표본은 -80ºC 냉동고의 두 번째 Bio-Repository에 보관됩니다. 사용하지 않은 조직은 동일한 비식별 시퀀스 및 바코드로 라벨을 지정하고 12개월 이상 6개월 이하의 기간 동안 -80ºC 냉동고에 보관합니다(First Bio-Repository).

다른 라벨이 붙은 하위 표본을 처리하기 위해 미생물 배양 분석을 받기 위해 15mL 표본 수집 바이알에 있는 CML(Clinical Microbiology Laboratory)로 운반됩니다. 미생물학 배양 분석 완료 후, CML에서 배양 플레이트로부터 특정 박테리아 콜로니를 분리하고 뉴클레오티드 보존 용액(RNAlater(R))에서 처리할 것이다. Second Bio-Repository의 대응물과 유사하게 표본은 NGS 분석을 위해 일괄 처리됩니다. 충분히 일괄 처리되면 Shotgun Whole Genome Sequencing 분석을 사용하여 NGS 분석 전에 NGS 시설 직원이 세 번째 생물 저장소의 표본을 뉴클레오티드 추출합니다. 환자/LAR은 임상 직원이 연구를 소개한 후 정보에 입각한 동의를 위해 접근하고 정보에 입각한 동의에 관한 추가 정보가 수용 가능함을 확인합니다. 사전에 서명한 동의서를 받으면 임상적으로 관련된 상처 관련 데이터가 동일한 비식별 라벨 아래 첫 번째 데이터베이스에 대해 수집됩니다. 정보에 입각한 동의를 얻지 못하면 표본은 폐기되고 더 이상 고려되지 않습니다. 수집된 모든 정보는 비식별화된 고유 식별자에 연결되며, 이는 각 선조 표본에 고유합니다. 수집된 모든 데이터는 임상 기록과 독립적이며 안전하게 저장됩니다.

다음과 같은 환자별 데이터가 수집됩니다.

• 화상을 입었을 때 환자의 나이(년 단위로 입력)
• 화상 당시 환자의 성별(범주: 남성, 여성, 기타)
• 환자의 인종(카테고리: 백인, 흑인, 히스패닉, 아시아인, 아메리카 원주민, 태평양 섬 주민 등)
• 수술 당시 환자의 체중 및 BMI(숫자 입력)
• 임신 상태(범주는 긍정적, 부정적 또는 알 수 없음)
• COVID-19 상태(카테고리: 양성, 음성 또는 알 수 없음)
• 수술 후 24시간 이내에 경구 또는 IV 항생제(카테고리에는 반코마이신, 메로페넴, 답토마이신, Zosyn, 독시사이클린, Ancef, Bactrim, Augmentin, 모든 항진균제 또는 모든 항바이러스제가 있음)
• 약물 치료 클래스 - 가정 및 입원 환자(카테고리: 당뇨병 치료, 스테로이드, 면역 요법 또는 화학 요법)
• 현재 입학에서 피험자와 관련된 이전의 비식별 시퀀스
• TBSA 연소(입력은 숫자: 전체 신체 표면적의 %)

다음과 같은 상처 관련 데이터가 수집됩니다.

• 입원일수 및 수거일의 입원일수(숫자로 입력)
• 화상 부상 이후 일수(숫자 입력)
• 검체 수집 시 수술을 포함하여 현재 입원 중 수술 개입 횟수(숫자 입력)
• 다른 시설에서 수행된 수술, 이전 UTMB 입원 시 수행된 수술 및 표본 수집 시 수술을 포함하여 지표 화상과 관련된 총 수술 중재 횟수(입력은 숫자임)
• 표본이 수집된 신체 위치(범주는 상지(팔 또는 손), 하지(다리 또는 발), 전방 흉부, 후방 흉부 또는 머리/목임). 생식기 및 사타구니의 조직은 수집되지 않습니다.
• 입원 시 결정된 총 체표면적 화상(TBSA) 비율(입력은 숫자임)
• 검체 채취 부위에서 전체 두께 또는 3도 화상 깊이에 대한 우려(범주는 예 또는 아니오)
• 표본이 수집되는 부위에서 추정되는 조직 유형(범주는 피부, 피하 또는 근막)
• 화상의 원인(범주는 화염, 화상, 접촉, 화학적, 전기적 또는 기타)
• 수술 직전 조직으로 상처에 대한 항균 상처 치료를 수집하고 있습니다. 은 기반 합성 드레싱).

생물통계학

다음 질문에 답하기 위해 데이터를 분석하기 위해 Bio-Repository에 포함할 최소 300개의 전구체 샘플을 수집할 것을 제안합니다.

• NGS 화상 상처 마이크로바이옴과 전통적 배양 기술 사이의 상관관계는 무엇입니까?
• 화상 상처에서 미생물 종의 상대적인 분포는 무엇입니까?
• 전통적인 기술과 비교하여 화상 상처의 미생물 수와 농도의 상대적인 분포는 무엇입니까?

이러한 모든 질문은 비식별 처리된 폐기 샘플로만 답할 수 있습니다. 추가 질문의 경우 관련 임상 및 상처 관련 데이터가 있는 샘플을 사용하여 다음 질문에 답할 수 있습니다.

• 환자의 나이에 따라 다른 화상 상처 마이크로바이옴이 발생합니까? 이것이 고전문화기법에 반영된 것인가?
• 성별이 화상 상처 마이크로바이옴에 영향을 미칩니까? 이것이 고전문화기법에 반영된 것인가?
• 인종이 화상 상처 마이크로바이옴에 영향을 미칩니까? 체중과 BMI? 임신? 코로나 19? 굽기 크기?
• 국소 및/또는 전신 항생제 사용이 화상 상처 미생물 군집에 영향을 미칩니까?
• 화상 상처의 나이가 화상 상처 미생물 군집에 영향을 미칩니까? 이전 또는 후속 수술 개입 횟수가 영향을 줍니까?
• 손상된 신체 부위가 화상 상처 미생물 군집에 영향을 미칩니까?

통계 분석:

연속 변수에 대한 기술 통계는 평균 ± SD로, 범주형 변수는 빈도 및 비율로 표시됩니다. 이변량 분석에는 정규성 가정이 위반되지 않는 Pearson 상관 계수 및 정규성이 가정되지 않는 Spearman의 rho와의 상관 관계 테스트가 포함됩니다. 다중 선형 회귀 모델을 사용하여 NGS 화상 상처 미생물 군집과 전통적인 배양 기술 간의 관계를 평가하고 성인 화상 환자로부터 수집한 생물 표본에서 화상 상처 미생물 군집의 예측 인자를 결정할 것입니다. 전체 다중 회귀 모델에서 진단 테스트가 수행됩니다. 0.01 수준의 알파에 대해 양면 통계적 유의성이 고려됩니다.

검정력 분석: 예측 모델에 대한 검정력 분석은 alpha=0.01에서 20개의 예측 변수를 사용하여 0.12의 예상 r2에서 계산된 0.136의 효과 크기 f2와 90%에서 귀무 가설을 기각하는 f 검정의 검정력에 기반했습니다. 90% 검정력 및 알파=0.01에서 종속 변수(화상의 미생물 군집)에 대한 변동의 최소 12%를 설명하기 위해 20개의 예측 변수가 있는 모델에 필요한 샘플 크기는 271개의 선조 샘플입니다. 우리는 10%의 분석 실패를 설명하기 위해 300개의 전구체 샘플을 수집하는 것을 목표로 합니다. 제안된 이 샘플 크기를 추정하기 위해 f 테스트 제품군에서 G*power(버전 3.1.9.7)를 사용했습니다.