Zrozumienie mikrobiomu ran oparzeniowych: porównanie tradycyjnych kultur ran z technologią sekwencjonowania nowej generacji

1. - WPROWADZENIE: Mikrobiom człowieka składa się z mikroorganizmów, w tym bakterii, grzybów, archeonów i wirusów, które żyją w powiązaniu z organizmem. U przeciętnego człowieka same bakterie przewyższają liczebnie komórki gospodarza dziesięciokrotnie i zawierają o tysiąc genów więcej niż ludzki genom. Dlatego, mimo że składa się z <3% biomasy organizmu, ludzki mikrobiom odgrywa kluczową rolę w tworzeniu i utrzymywaniu złożonej biomechaniki naszego zdrowia i rozwoju. W ciągu ostatnich dwóch dekad projekt NIH Human Microbiome Project zwrócił uwagę na szereg nowo odkrytych wpływów mikrobiomu na fizjologię człowieka (Turnbaugh i in., 2007). Pomimo niezwykłego postępu osiągniętego w ciągu ostatnich dwóch dekad dopiero niedawno zaczęto rozszyfrowywać różnorodny ekosystem mikrobiomu obecny w ranach skórnych i ich wpływ na regenerację żywiciela, odpowiedź immunologiczną i gojenie się ran. Do tej pory mamy tylko powierzchowne zrozumienie mikrobiomu ran oparzeniowych i jego wpływu na infekcję, zapalenie ogólnoustrojowe, gojenie się ran i ostatecznie rokowanie pacjenta.

2. - TŁO: Ciężkie oparzenia są głównym globalnym źródłem zachorowalności i śmiertelności. Według National Center for Injury Prevention and Control oraz American Burn Association, w samych Stanach Zjednoczonych każdego roku 450 000 pacjentów doznaje oparzeń termicznych; spośród przyjętych na leczenie 3% nie przeżyje, głównie z powodu infekcji i sepsy. Po ciężkim oparzeniu wzorzec kolonizacji drobnoustrojów w ranach oparzeniowych przebiega według stosunkowo przewidywalnej sekwencji suplementacji, zaczynając od bakterii Gram-dodatnich, następnie bakterii Gram-ujemnych, a następnie bardziej zjadliwych patogenów. Kilka badań wykazało, że długość hospitalizacji jest związana z gatunkami drobnoustrojów wyizolowanymi z ran oparzeniowych. Liczne badania dotyczyły mikrobiomu przewlekłych ran skórnych i wykazały, że na gojenie mają wpływ zarówno patologiczne, jak i korzystne populacje drobnoustrojów. Tradycyjna analiza kultur mikrobiologicznych jest substytutem rzeczywistego mikrobiomu rany, ale nie pozwala na identyfikację całego ekosystemu mikrobiologicznego obecnego w ranach oparzeniowych, ponieważ wiele gatunków trudno hodować w standardowych warunkach, a samo środowisko hodowlane znacznie różni się od środowiska rany. Ponadto mikrobiom rany jest dynamiczny i zmienia się pod wpływem czynników środowiskowych, środków do pielęgnacji ran, odpowiedzi immunologicznej gospodarza i leków. Ponadto zakończenie tradycyjnych posiewów z rany zajmuje kilka dni iw tym czasie może już nie odzwierciedlać obecnych drobnoustrojów zamieszkujących samą ranę. Wreszcie, wiele uwagi poświęca się znanym chorobotwórczym gatunkom i szczepom wielolekoopornym (Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Enterobacteriaceae oporne na karbapenemy, by wymienić tylko kilka), ale często pomija się obecność i wpływ korzystnych gatunków.

   Niezależne od hodowli metody wykorzystujące technologię sekwencjonowania nowej generacji (NGS), takie jak sekwencjonowanie amplikonów 16S i 18S oraz sekwencjonowanie strzelbą metagenomową, okazały się szybsze i bardziej czułe niż tradycyjne kultury mikrobiologiczne. Technologia 16S NGS wykorzystuje 16S rDNA do kodowania sekwencji rybosomalnego rRNA prokariotów. W sekwencji 16S rDNA obecnych jest dziewięć regionów zmiennych, których celem są różnice genetyczne między gatunkami bakterii. W podobny sposób technologia 18S NGS koduje sekwencje rybosomalnego rRNA eukariontów, a regiony zmienne są wykorzystywane do klasyfikowania różnic gatunkowych między mikroorganizmami eukariotycznymi w próbce.

3. - PROCEDURY BADANIA Zbieranie próbek i danych: Dane dotyczące ran oparzeniowych/bio-repozytorium będą gromadzić próbki biologiczne z wyciętych tkanek ran oparzeniowych, które zostaną wyrzucone przez zespół chirurgów. Nie więcej niż dwie próbki progenitorowe zostaną pobrane z każdego pojedynczego przypadku operacyjnego. Każda próbka zostanie podzielona w momencie pobrania na dwie podpróbki, z których każda waży około 0,5-2 gramów. Każda próbka musi pochodzić tylko z jednego określonego obszaru ciała sklasyfikowanego jako kończyny górne (ramię lub dłoń), kończyny dolne (noga lub stopa), przednia część klatki piersiowej, tylna część klatki piersiowej lub głowa/szyja. Ponadto nie będą pobierane żadne próbki z genitaliów ani krocza ze względu na wysokie ryzyko zanieczyszczenia próbki.

Podpróbki zostaną natychmiast przetransportowane na lodzie i tymczasowo przechowywane w zamrażarce -20ºC, następnie część tkanki (mniej niż 0,5 cm) zostanie umieszczona w RNAlater(R) RNA Stabilization Solution (RNAlater(R)) w celu do zachowania/stabilizacji nukleotydów. Tkanka umieszczona w RNAlater® zostanie schłodzona w temperaturze 4ºC przez noc, aby umożliwić wystarczającą penetrację tkanki. Następnie zakonserwowane okazy będą przechowywane w temperaturze od -20ºC do -80ºC. Proces ten zostanie przeprowadzony w ciągu 1 godziny od pobrania. Każda podpróbka wygeneruje dwie dodatkowe próbki do umieszczenia w RNAlater(R). Po początkowym okresie chłodzenia próbki RNAlater(R) będą przechowywane w Drugim Bio-Repozytorium w zamrażarce -80ºC. Niewykorzystana tkanka zostanie oznaczona tą samą zdezidentyfikowaną sekwencją i kodem kreskowym i będzie przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80ºC przez okres nie dłuższy niż 12 miesięcy i nie krótszy niż 6 miesięcy (Pierwsze Bio-Repozytorium).

W przypadku innych oznakowanych podpróbek zostanie ona przetransportowana do Laboratorium Mikrobiologii Klinicznej (CML) w 15 ml fiolce do pobierania próbek w celu poddania ich analizie mikrobiologicznej. Po zakończeniu analizy mikrobiologicznej hodowli, określone kolonie bakteryjne z płytek hodowlanych w CML zostaną wyizolowane i przetworzone w roztworze konserwującym nukleotydy (RNAlater®). Podobnie jak ich odpowiedniki z Drugiego Bio-Repozytorium, próbki zostaną podzielone na partie do analizy NGS. Po dostarczeniu odpowiedniej partii próbki z trzeciego biorepozytorium zostaną poddane ekstrakcji nukleotydów przez personel obiektu NGS przed analizą NGS przy użyciu analizy sekwencjonowania całego genomu Shotgun. Pacjenci/LAR zostaną poproszeni o świadomą zgodę po wprowadzeniu do badania przez personel kliniczny i potwierdzeniu, że więcej informacji dotyczących świadomej zgody jest dopuszczalne. Po uzyskaniu podpisanej świadomej zgody istotne klinicznie dane dotyczące konkretnej rany zostaną zebrane w Pierwszej Bazie Danych pod tą samą pozbawioną elementów identyfikacyjnych etykietą. Jeżeli świadoma zgoda nie zostanie uzyskana, próbki zostaną odrzucone i nie będą dalej rozpatrywane. Wszystkie zebrane informacje zostaną powiązane z pozbawionymi elementów identyfikacyjnych niepowtarzalnymi identyfikatorami, które będą specyficzne dla każdego okazu progenitorowego. Wszystkie zebrane dane będą niezależne od dokumentacji klinicznej i bezpiecznie przechowywane.

Zostaną zebrane następujące dane dotyczące pacjenta:

• Wiek pacjenta w latach w chwili oparzenia (wprowadzanie jest liczbowe w latach)
• Płeć pacjenta w momencie oparzenia (kategorie to Mężczyzna, Kobieta, Inny)
• Pochodzenie etniczne pacjenta (kategorie to biali, czarni, Latynosi, Azjaci, rdzenni Amerykanie, mieszkańcy wysp Pacyfiku i inni)
• Waga i BMI pacjenta w momencie operacji (wprowadzanie jest numeryczne)
• Stan ciąży (kategorie są pozytywne, negatywne lub nieznane)
• Status COVID-19 (kategorie są pozytywne, negatywne lub nieznane)
• Antybiotyki doustne lub dożylne podane w ciągu 24 godzin po operacji (kategorie to wankomycyna, meropenem, daptomycyna, Zosyn, doksycyklina, Ancef, Bactrim, Augmentin, dowolny lek przeciwgrzybiczy lub przeciwwirusowy)
• Klasa leków - domowa i szpitalna (kategorie to terapia cukrzycowa, sterydy, immunoterapia lub chemioterapia)
• Każda wcześniejsza zdezidentyfikowana sekwencja związana z pacjentem z obecnego przyjęcia
• Oparzenie TBSA (dane wejściowe są liczbowe: % całkowitej powierzchni ciała)

Zostaną zebrane następujące dane dotyczące rany:

• Dni od przyjęcia i dni pobytu w szpitalu w dniu pobrania (wprowadzanie jest numeryczne)
• Dni od oparzenia (wprowadzanie jest numeryczne)
• Liczba interwencji operacyjnych podczas bieżącego przyjęcia, w tym operacji w momencie pobrania próbki (dane wejściowe są numeryczne)
• Łączna liczba interwencji operacyjnych związanych z oparzeniami wskaźnikowymi, w tym operacje wykonane w innych ośrodkach, operacje wykonane podczas poprzednich przyjęć do UTMB oraz operacja w momencie pobrania próbki (dane wejściowe są liczbowe)
• Lokalizacja ciała, z którego pobrano próbkę (kategorie to: kończyna górna, ręka lub ręka, kończyna dolna, noga lub stopa, przednia część klatki piersiowej, tylna część klatki piersiowej lub głowa/szyja). Tkanki z genitaliów i pachwin nie będą pobierane.
• Procent spalonej całkowitej powierzchni ciała (TBSA) określony przy przyjęciu (dane wejściowe są numeryczne)
• Obawa o pełną grubość lub głębokość oparzenia 3. stopnia z miejsca pobrania próbki (kategorie: tak lub nie)
• Przypuszczalny rodzaj tkanki z miejsca pobrania próbki (kategorie: skórna, podskórna lub mięśniowo-powięziowa)
• Etiologia oparzenia (kategorie: płomień, oparzenie, kontakt, chemiczne, elektryczne lub inne)
• Środki przeciwdrobnoustrojowe do pielęgnacji ran bezpośrednio przed operacją na ranie z pobieraną tkanką (kategorie obejmują maść z antybiotykiem, irygację roztworem Dakinsa, irygację azotanem srebra, irygację octanem mafenidu, namaczanie amfoterycyny, krem ​​z sulfadiazyną srebra, syntetyczny opatrunek na bazie srebra, nie- syntetyczny opatrunek na bazie srebra).

BIOSTATYSTYKA

Proponujemy zebranie co najmniej 300 próbek progenitorowych do włączenia do Bio-Repozytorium w celu analizy danych w celu udzielenia odpowiedzi (przynajmniej) na następujące pytania:

• Jaka jest korelacja między mikrobiomem rany oparzeniowej NGS a tradycyjnymi technikami hodowli?
• Jaka jest względna dystrybucja gatunków drobnoustrojów w ranie oparzeniowej?
• Jaki jest względny rozkład liczby i stężenia drobnoustrojów w ranach oparzeniowych w porównaniu z tradycyjnymi technikami?

Na wszystkie te pytania można odpowiedzieć wyłącznie za pomocą odrzuconych próbek pozbawionych cech identyfikacyjnych. W przypadku dodatkowych pytań, próbki z powiązanymi danymi klinicznymi i danymi specyficznymi dla rany mogą posłużyć do uzyskania odpowiedzi na następujące pytania:

• Czy wiek w latach pacjenta wpływa na inny mikrobiom rany oparzeniowej? Czy znajduje to odzwierciedlenie w technikach kultury klasycznej?
• Czy płeć ma jakikolwiek wpływ na mikrobiom ran oparzeniowych? Czy znajduje to odzwierciedlenie w klasycznych technikach kultury?
• Czy pochodzenie etniczne wpływa na mikrobiom ran oparzeniowych? Waga i BMI? Ciąża? COVID 19? Rozmiar spalania?
• Czy miejscowe i/lub ogólnoustrojowe stosowanie antybiotyków wpływa na mikrobiom rany oparzeniowej?
• Czy wiek rany oparzeniowej wpływa na mikrobiom rany oparzeniowej? Czy liczba wcześniejszych lub kolejnych interwencji operacyjnych ma jakikolwiek wpływ?
• Czy uszkodzony obszar ciała ma jakikolwiek wpływ na mikrobiom rany oparzeniowej?

ANALIZA STATYSTYCZNA:

Statystyki opisowe dla zmiennych ciągłych zostaną przedstawione jako średnia ± SD, a dla zmiennych kategorycznych jako częstości i proporcje. Analiza dwuwymiarowa będzie obejmowała testowanie korelacji ze współczynnikiem korelacji Pearsona, gdy założenie o normalności nie jest naruszone, oraz rho Spearmana, gdy nie zakłada się normalności. Korzystając z wielu modeli regresji liniowej, ocenimy związek między mikrobiomem rany oparzeniowej NGS a tradycyjnymi technikami hodowli, a także określimy predyktory mikrobiomu rany oparzeniowej w pobranych biopróbkach od dorosłych pacjentów z oparzeniami. Testy diagnostyczne zostaną przeprowadzone na pełnych modelach regresji wielokrotnej. Dwustronna istotność statystyczna będzie brana pod uwagę dla alfa na poziomie 0,01.

Analiza mocy: Analiza mocy dla naszego modelu prognostycznego została oparta na wielkości efektu f2 równej 0,136 obliczonej na podstawie przewidywanego r2 równego 0,12 z 20 predyktorami na poziomie alfa=0,01 oraz dla mocy testu f odrzucającej hipotezę zerową na poziomie 90%. Wielkość próbki potrzebna dla takiego modelu z 20 predyktorami, aby wyjaśnić co najmniej 12% zmienności zmiennej zależnej (mikrobiom rany oparzeniowej) przy mocy 90% i alfa=0,01, wynosi 271 próbek prekursorowych. Naszym celem jest zebranie 300 próbek progenitorowych, aby uwzględnić 10% błędów analitycznych. Użyliśmy mocy G* (wersja 3.1.9.7) w ramach rodziny testów f, aby oszacować sugerowaną wielkość próby.