Das Mikrobiom von Brandwunden verstehen: Vergleich herkömmlicher Wundkulturen mit der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation

1. - EINFÜHRUNG: Das menschliche Mikrobiom besteht aus Mikroorganismen, darunter Bakterien, Pilze, Archaeen und Viren, die in Verbindung mit dem Körper leben. Bei einem durchschnittlichen Menschen überwiegen Bakterien allein die Anzahl der Wirtszellen um das Zehnfache und enthalten tausend Gene mehr als das menschliche Genom. Daher spielt das menschliche Mikrobiom, obwohl es aus <3% der körpereigenen Biomasse besteht, eine entscheidende Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der komplexen Biomechanik unserer Gesundheit und Entwicklung. In den letzten zwei Jahrzehnten hat das NIH Human Microbiome Project eine Reihe neu entdeckter Einflüsse des Mikrobioms auf die menschliche Physiologie ins Rampenlicht gerückt (Turnbaugh et al., 2007). Trotz der bemerkenswerten Fortschritte, die in den letzten zwei Jahrzehnten erzielt wurden, hat die Entschlüsselung des vielfältigen Ökosystems der Mikrobiota in Hautwunden und ihres Einflusses auf die Regeneration des Wirts, die Immunantwort und die Wundheilung erst vor kurzem begonnen. Bis heute haben wir nur ein oberflächliches Verständnis des Mikrobioms von Brandwunden und seiner Auswirkungen auf Infektionen, systemische Entzündungen, Wundheilung und letztendlich die Patientenprognose.

2. - HINTERGRUND: Schwere Verbrennungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Nach Angaben des National Center for Injury Prevention and Control und der American Burn Association erleiden allein in den Vereinigten Staaten jedes Jahr 450.000 Patienten thermische Verbrennungen; von denen, die zur Behandlung zugelassen werden, überleben 3 % nicht, hauptsächlich aufgrund von Infektionen und Sepsis. Nach schweren Verbrennungen folgt das Muster der mikrobiellen Besiedelung in Brandwunden einer relativ vorhersagbaren Reihenfolge der Supplementierung, beginnend mit grampositiven Bakterien, gefolgt von gramnegativen Bakterien und anschließend virulenteren Krankheitserregern. Mehrere Studien zeigten, dass die Dauer des Krankenhausaufenthalts mit den aus Brandwunden isolierten mikrobiellen Arten zusammenhängt. Zahlreiche Studien untersuchten das Mikrobiom chronischer Hautwunden mit Ergebnissen, die darauf hindeuten, dass die Heilung sowohl von pathologischen als auch von nützlichen mikrobiellen Populationen beeinflusst wird. Die traditionelle mikrobiologische Kulturanalyse ist ein Ersatz für das tatsächliche Wundmikrobiom, kann jedoch nicht den vollen Atem des in Brandwunden vorhandenen mikrobiellen Ökosystems identifizieren, da viele Arten unter Standardbedingungen schwer zu kultivieren sind und sich die Kulturumgebung selbst erheblich von der Wundumgebung unterscheidet. Darüber hinaus ist das Wundmikrobiom dynamisch und wird durch Umweltfaktoren, Wundpflegemittel, die Immunantwort des Wirts und Medikamente beeinflusst. Darüber hinaus benötigen traditionelle Wundkulturen mehrere Tage, um fertig zu werden, und im Laufe dieser Zeit können sie möglicherweise nicht mehr die aktuellen mikrobiellen Bewohner der Wunde selbst widerspiegeln. Schließlich wird viel Aufmerksamkeit auf bekannte pathogene Arten und multiresistente Stämme (Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Carbapenem-resistente Enterobacteriaceae, um nur einige zu nennen) gerichtet, aber das Vorhandensein und der Einfluss nützlicher Arten wird oft übersehen.

   Kulturunabhängige Methoden mit Next Generation Sequencing (NGS)-Technologie, wie die 16S- und 18S-Amplikonsequenzierung und die Metagenom-Shotgun-Sequenzierung, haben sich als schneller und empfindlicher als herkömmliche mikrobiologische Kulturen erwiesen. Die 16S-NGS-Technologie nutzt 16S-rDNA zur Kodierung für ribosomale rRNA-Sequenzen von Prokaryoten. Innerhalb der 16S-rDNA-Sequenz sind neun variable Regionen vorhanden, die auf genetische Unterschiede zwischen Bakterienarten abzielen. Auf ähnliche Weise kodiert die 18S-NGS-Technologie für ribosomale rRNA-Sequenzen von Eukaryoten, und die variablen Regionen werden verwendet, um Artenunterschiede zwischen eukaryotischen Mikroorganismen in einer Probe zu klassifizieren.

3. - STUDIENVERFAHREN Proben- und Datensammlung: Das Burn Wound Data/Bio-Repository sammelt Bioproben aus exzidiertem Brandwundengewebe, die vom Operationsteam entsorgt werden. Von jedem einzelnen operativen Fall werden nicht mehr als zwei Vorläuferproben entnommen. Jede Probe wird zum Zeitpunkt der Entnahme in zwei Unterproben geteilt, die jeweils etwa 0,5 bis 2 Gramm wiegen. Jede Probe darf nur aus einer bestimmten Körperregion stammen, die als obere Extremitäten (entweder Arm oder Hand), untere Extremitäten (entweder Bein oder Fuß), vorderer Brustkorb, hinterer Brustkorb oder Kopf/Hals klassifiziert sind. Darüber hinaus werden aufgrund des hohen Risikos einer Probenkontamination keine Proben aus den Genitalien oder dem Perineum entnommen.

Die Unterproben werden sofort auf Eis transportiert und vorübergehend in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert, dann wird ein Teil des Gewebes (weniger als 0,5 cm) der Reihe nach in RNAlater(R) RNA Stabilization Solution (RNAlater(R)) gelegt zur Nukleotidkonservierung/-stabilisierung. In RNAlater(R) eingelegtes Gewebe wird über Nacht bei 4 °C gekühlt, um eine ausreichende Gewebepenetration zu ermöglichen. Danach werden konservierte Proben bei -20ºC bis -80ºC gelagert. Dieser Vorgang wird innerhalb von 1 Stunde nach der Abholung durchgeführt. Jede Unterprobe erzeugt zwei zusätzliche Proben, die in RNAlater(R) platziert werden. Nach der anfänglichen Kühlphase werden RNAlater(R)-Proben im Second Bio-Repository in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert. Unbenutztes Gewebe wird mit der gleichen anonymisierten Sequenz und dem gleichen Barcode gekennzeichnet und in einem Gefrierschrank bei -80 °C für einen Zeitraum von nicht mehr als 12 Monaten und nicht weniger als 6 Monaten gelagert (erstes Biolager).

Um die andere markierte Unterprobe zu adressieren, wird sie in einem 15-ml-Probensammelfläschchen zum Clinical Microbiology Laboratory (CML) transportiert, um einer mikrobiologischen Kulturanalyse unterzogen zu werden. Nach Abschluss der mikrobiologischen Kulturanalyse werden spezifische Bakterienkolonien aus den Kulturplatten am CML isoliert und in einer nukleotidkonservierenden Lösung (RNAlater®) aufgearbeitet. Ähnlich wie ihre Gegenstücke aus dem Second Bio-Repository werden die Proben für die NGS-Analyse gebündelt. Bei ausreichender Chargenbildung werden Proben aus dem dritten Bio-Repository vor der NGS-Analyse mittels Shotgun Whole Genome Sequencing-Analyse einer Nukleotidextraktion durch das Personal der NGS-Einrichtung unterzogen. Die Patienten/LARs werden nach der Einführung in die Studie durch das klinische Personal um eine Einwilligung nach Aufklärung gebeten und bestätigt, dass weitere Informationen zur Einwilligung nach Aufklärung akzeptabel sind. Sobald die unterschriebene Einverständniserklärung eingeholt wurde, werden klinisch relevante wundspezifische Daten für die First Database unter demselben anonymisierten Etikett gesammelt. Wenn keine Einverständniserklärung eingeholt wird, werden die Proben verworfen und nicht weiter berücksichtigt. Alle gesammelten Informationen werden mit den anonymisierten eindeutigen Identifikatoren verknüpft, die für jedes Vorfahrenexemplar spezifisch sind. Alle erhobenen Daten werden unabhängig von der Krankenakte sicher gespeichert.

Folgende patientenspezifische Daten werden erhoben:

• Alter des Patienten in Jahren zum Zeitpunkt der Brandverletzung (Eingabe erfolgt numerisch in Jahren)
• Geschlecht des Patienten zum Zeitpunkt der Brandverletzung (Kategorien sind männlich, weiblich, andere)
• Ethnizität des Patienten (Kategorien sind weiß, schwarz, hispanisch, asiatisch, indianisch, pazifische Inselbewohner und andere)
• Gewicht und BMI des Patienten zum Zeitpunkt der Operation (Eingabe ist numerisch)
• Schwangerschaftsstatus (Kategorien sind positiv, negativ oder unbekannt)
• COVID-19-Status (Kategorien sind positiv, negativ oder unbekannt)
• Orale oder intravenöse Antibiotika, die innerhalb von 24 Stunden nach der Operation erhalten wurden (Kategorien sind Vancomycin, Meropenem, Daptomycin, Zosyn, Doxycyclin, Ancef, Bactrim, Augmentin, jedes Antimykotikum oder jedes antivirale Mittel)
• Medikationsklasse – zu Hause und stationär (Kategorien sind Diabetestherapie, Steroide, Immuntherapie oder Chemotherapie)
• Jede frühere deidentifizierte Sequenz, die dem Subjekt der aktuellen Aufnahme zugeordnet ist
• TBSA verbrannt (Eingabe ist numerisch: % gesamte Körperoberfläche)

Folgende wundspezifische Daten werden erhoben:

• Tage seit Aufnahme und Krankenhaustage am Tag der Entnahme (Eingabe ist numerisch)
• Tage seit Brandverletzung (Eingabe ist numerisch)
• Anzahl operativer Eingriffe während der aktuellen Aufnahme einschließlich der Operation zum Zeitpunkt der Probenentnahme (Eingabe ist numerisch)
• Anzahl der gesamten operativen Eingriffe im Zusammenhang mit Indexbrandverletzungen, einschließlich Operationen, die in anderen Einrichtungen durchgeführt wurden, Operationen, die bei früheren Aufnahmen in UTMB durchgeführt wurden, und die Operation zum Zeitpunkt der Probenentnahme (Eingabe ist numerisch)
• Körperstelle, an der die Probe entnommen wird (Kategorien sind obere Extremität entweder Arm oder Hand, untere Extremität entweder Bein oder Fuß, vorderer Thorax, hinterer Thorax oder Kopf/Hals). Gewebe aus den Genitalien und der Leiste wird nicht entnommen.
• Prozentsatz der verbrannten Gesamtkörperoberfläche (TBSA), wie bei der Aufnahme bestimmt (Eingabe ist numerisch)
• Besorgnis über die gesamte Dicke oder Tiefe von Verbrennungen 3. Grades von der Stelle, an der die Probe entnommen wird (Kategorien sind ja oder nein)
• Vermuteter Gewebetyp von der Stelle, an der die Probe entnommen wird (Kategorien sind kutan, subkutan oder myofaszial)
• Ätiologie von Brandverletzungen (Kategorien sind Flammen, Verbrühungen, Kontakt, Chemikalien, Elektrik oder andere)
• Antimikrobielle Wundversorgung unmittelbar vor der Operation an der Wunde, aus der Gewebe entnommen wird (Kategorien umfassen antibiotische Salbe, Spülung mit Dakins-Lösung, Silbernitrat-Spülung, Mafenidacetat-Spülung, Amphotericin-Einweichungen, Silbersulfadiazin-Creme, synthetischer Verband auf Silberbasis, nicht synthetischer Verband auf Silberbasis).

BIO-STATISTIKEN

Wir schlagen vor, mindestens 300 Vorläuferproben zu sammeln, um sie in das Bio-Repository aufzunehmen, um Daten zu analysieren, um (mindestens) die folgenden Fragen zu beantworten:

• Welcher Zusammenhang besteht zwischen dem NGS-Brandwundenmikrobiom und traditionellen Kulturtechniken?
• Wie ist die relative Verteilung der Mikrobenarten in der Brandwunde?
• Wie ist die relative Verteilung der Mikrobenzahl und -konzentration in Brandwunden im Vergleich zu herkömmlichen Techniken?

All diese Fragen lassen sich allein mit de-identifizierten Aussonderungsproben beantworten. Bei weiteren Fragen können diese Proben mit zugehörigen klinischen und wundspezifischen Daten verwendet werden, um Folgendes zu beantworten:

• Erzeugt das Alter des Patienten in Jahren ein unterschiedliches Brandwundenmikrobiom? Wird dies mit klassischen Kulturtechniken reflektiert?
• Hat das Geschlecht einen Einfluss auf das Mikrobiom von Brandwunden? Wird dies mit klassischen Kulturtechniken reflektiert?
• Beeinflusst die ethnische Zugehörigkeit das Mikrobiom von Brandwunden? Gewicht und BMI? Schwangerschaft? COVID 19? Brenngröße?
• Beeinflusst die topische und/oder systemische Anwendung von Antibiotika das Mikrobiom der Brandwunde?
• Beeinflusst das Alter der Brandwunde das Mikrobiom der Brandwunde? Hat die Anzahl vorangegangener oder nachfolgender operativer Eingriffe einen Einfluss?
• Hat die verletzte Körperregion einen Einfluss auf das Mikrobiom der Brandwunde?

STATISTISCHE ANALYSE:

Deskriptive Statistiken für kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung und für kategoriale Variablen als Häufigkeiten und Anteile dargestellt. Die bivariate Analyse umfasst Korrelationstests mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten, wenn die Normalitätsannahme nicht verletzt wird, und Spearmans Rho, wenn keine Normalität angenommen wird. Unter Verwendung multipler linearer Regressionsmodelle werden wir die Beziehung zwischen NGS-Brandwunden-Mikrobiom und traditionellen Kulturtechniken bewerten sowie die Prädiktoren für das Brandwunden-Mikrobiom in gesammelten Bioproben von erwachsenen Patienten mit Verbrennungen bestimmen. Diagnostische Tests werden an den vollständigen multiplen Regressionsmodellen durchgeführt. Zweiseitige statistische Signifikanz wird für Alpha auf dem Niveau von 0,01 berücksichtigt.

Power-Analyse: Die Power-Analyse für unser Vorhersagemodell basierte auf einer Effektgröße f2 von 0,136, berechnet aus einem erwarteten r2 von 0,12 mit 20 Prädiktoren bei Alpha = 0,01 und für eine Power des f-Tests, um die Nullhypothese bei 90 % abzulehnen. Die Stichprobengröße, die für ein solches Modell mit 20 Prädiktoren benötigt wird, um mindestens 12 % der Variation der abhängigen Variablen (Brandwunde-Mikrobiom) bei 90 % Trennschärfe und Alpha = 0,01 zu erklären, beträgt 271 Vorläuferstichproben. Unser Ziel ist es, 300 Vorläuferproben zu sammeln, um 10 % analytisches Versagen auszugleichen. Wir haben G*power (Version 3.1.9.7) unter der f-Testfamilie verwendet, um diese vorgeschlagene Stichprobengröße zu schätzen.