Forståelse af brændsårsmikrobiomet: Sammenligning af traditionelle sårkulturer med næste generations sekvenseringsteknologi

1. - INTRODUKTION: Det menneskelige mikrobiom består af mikroorganismer, herunder bakterier, svampe, arkæer og vira, der lever i forbindelse med kroppen. Hos den gennemsnitlige person er bakterier alene ti gange flere end værtsceller og indeholder tusind flere gener end det menneskelige genom. Derfor, på trods af at det består af <3% af kroppens biomasse, spiller det menneskelige mikrobiom en afgørende rolle i etablering og vedligeholdelse af den komplekse biomekanik af vores sundhed og udvikling. I de sidste to årtier har NIH Human Microbiome Project sat fokus på en række nyopdagede påvirkninger, som mikrobiomet har på menneskets fysiologi (Turnbaugh et al., 2007). På trods af de bemærkelsesværdige fremskridt, der er opnået i de sidste to årtier, er det mangfoldige økosystem af mikrobiota, der er til stede i kutane sår, og deres indflydelse på værtsregenerering, immunrespons og sårheling først for nylig begyndt at blive dechiffreret. Til dato har vi kun en overfladisk forståelse af brandsårsmikrobiomet og dets indvirkning på infektion, systemisk inflammation, sårheling og i sidste ende patientprognose.

2. - BAGGRUND: Alvorlige forbrændinger er en stor global kilde til sygelighed og dødelighed. Ifølge National Center for Injury Prevention and Control og American Burn Association lider 450.000 patienter af termiske forbrændinger hvert år alene i USA; af de indlagte til behandling vil 3 % ikke overleve mest på grund af infektion og sepsis. Efter alvorlig forbrænding følger mønsteret af mikrobiel kolonisering i forbrændingssår en relativt forudsigelig sekvens af tilskud, der begynder med gram-positive bakterier efterfulgt af gram-negative bakterier og efterfølgende mere virulente patogener. Adskillige undersøgelser viste, at længden af ​​hospitalsindlæggelse er forbundet med den mikrobielle art, der er isoleret fra forbrændingssår. Talrige undersøgelser undersøgte mikrobiomet af kroniske kutane sår med resultater, der tyder på, at heling er påvirket af både patologiske og gavnlige mikrobielle populationer. Traditionel mikrobiologisk kulturanalyse er et surrogat for det faktiske sårmikrobiom, men det lykkes ikke at identificere den fulde ånde fra det mikrobielle økosystem, der er til stede i forbrændingssår, da mange arter er vanskelige at dyrke under standardforhold, og selve kulturmiljøet adskiller sig væsentligt fra sårmiljøet. Desuden er sårmikrobiomet dynamisk og skiftende påvirket af miljøfaktorer, sårplejemidler, værtens immunrespons og medicin. Derudover tager traditionelle sårkulturer flere dage at færdiggøre og i løbet af en sådan tid afspejler de muligvis ikke længere de nuværende mikrobielle beboere i selve såret. Endelig er der stor opmærksomhed på kendte patogene arter og multi-lægemiddelresistente stammer (Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, carbapenem-resistente Enterobacteriaceae for at nævne nogle få), men tilstedeværelsen og indflydelsen af ​​gavnlige arter overses ofte.

   Kulturuafhængige metoder, der anvender Next Generation Sequencing (NGS) teknologi, såsom 16S og 18S amplicon sekventering og metagenom shotgun sekventering, har vist sig at være hurtigere og mere følsomme end traditionelle mikrobiologiske kulturer. 16S NGS-teknologi bruger 16S rDNA til at kode for ribosomale rRNA-sekvenser af prokaryoter. Ni variable regioner er til stede i 16S rDNA-sekvensen, som er målrettet mod genetiske forskelle mellem bakteriearter. På lignende måde koder 18S NGS-teknologi for ribosomale rRNA-sekvenser af eukaryoter, og de variable regioner bruges til at klassificere artsforskelle mellem eukaryote mikroorganismer i en prøve.

3. - UNDERSØGELSESPROCEDURER Prøve- og dataindsamling: Brændsårsdata/bio-depotet vil indsamle bioprøver fra udskåret brandsårvæv, som skal kasseres af det kirurgiske team. Der vil ikke blive indsamlet mere end to progenitor-prøver fra et individuelt operationstilfælde. Hver prøve vil blive opdelt på indsamlingstidspunktet i to underprøver, der hver vejer ca. 0,5-2 gram. Hver prøve må kun være fra én specifik kropsregion klassificeret som øvre ekstremiteter (enten arm eller hånd), underekstremiteter (enten ben eller fod), forreste thorax, posterior thorax eller hoved/hals. Derudover vil der ikke blive indsamlet prøver fra kønsorganerne eller perineum på grund af den høje risiko for prøvekontaminering.

Underprøverne transporteres straks på is og opbevares midlertidigt i en -20ºC fryser, hvorefter en del af vævet (mindre end 0,5 cm) placeres i RNAlater(R) RNA-stabiliseringsopløsning (RNAlater(R)) for at til nukleotidkonservering/stabilisering. Væv placeret i RNAlater(R) vil blive nedkølet ved 4ºC natten over for at tillade tilstrækkelig vævsgennemtrængning. Efterfølgende vil konserverede prøver blive opbevaret ved -20ºC til -80ºC. Denne proces vil blive udført inden for 1 time efter afhentning. Hver underprøve vil generere to yderligere prøver, der skal placeres i RNAlater(R). Efter den indledende periode med afkøling vil RNAlater(R)-prøver blive opbevaret i det andet biodepot i en -80ºC fryser. Ubrugt væv vil blive mærket med den samme afidentificerede sekvens og stregkode og opbevaret i en -80ºC fryser i en periode på højst 12 måneder og ikke mindre end 6 måneder (First Bio-Repository).

For at behandle den anden mærkede underprøve vil den blive transporteret til Clinical Microbiology Laboratory (CML) i et 15 ml prøveopsamlingshætteglas for at gennemgå mikrobiologisk kulturanalyse. Efter afslutning af den mikrobiologiske kulturanalyse vil specifikke bakteriekolonier fra kulturpladerne ved CML blive isoleret og behandlet i en nukleotidkonserverende opløsning (RNAlater(R)). I lighed med deres modstykker fra Second Bio-Repository, vil prøverne blive batchet til NGS-analyse. Når de er tilstrækkeligt batchede, vil prøver fra det tredje biodepot gennemgå nukleotidekstraktion af NGS Facility-personalet før NGS-analyse ved brug af Shotgun Whole Genome Sequencing-analyse. Patienter/LAR'er vil blive kontaktet for informeret samtykke efter introduktion til undersøgelsen af ​​det kliniske personale og bekræftet, at mere information vedrørende informeret samtykke er acceptabelt. Når først underskrevet informeret samtykke er opnået, vil klinisk relevante sårspecifikke data blive indsamlet til den første database under den samme afidentificerede etiket. Hvis der ikke opnås informeret samtykke, vil prøverne blive kasseret og ikke overvejet yderligere. Alle indsamlede oplysninger vil blive knyttet til de afidentificerede unikke identifikatorer, som vil være specifikke for hver progenitor-prøve. Alle indsamlede data vil være uafhængige af den kliniske journal og opbevares sikkert.

Følgende patientspecifikke data vil blive indsamlet:

• Patientens alder i år på tidspunktet for forbrændingsskade (input er numerisk i år)
• Patientens køn på tidspunktet for forbrændingsskade (kategorierne er Mand, Kvinde, Andet)
• Patientens etnicitet (kategorierne er hvid, sort, latinamerikansk, asiatisk, indiansk, stillehavsøboer og andre)
• Patientens vægt og BMI på operationstidspunktet (input er numerisk)
• Graviditetsstatus (kategorier er positive, negative eller ukendte)
• COVID-19-status (kategorier er positive, negative eller ukendte)
• Orale eller IV antibiotika modtaget inden for 24 timer efter operationen (kategorierne er vancomycin, meropenem, daptomycin, Zosyn, doxycyclin, Ancef, Bactrim, Augmentin, enhver anti-svampe eller anti-viral)
• Medicinklasse - hjemme og indlagt (kategorierne er diabetisk terapi, steroider, immunterapi eller kemoterapi)
• Enhver tidligere afidentificeret sekvens forbundet med emnet fra den aktuelle indlæggelse
• TBSA forbrændt (input er numerisk: % total kropsoverfladeareal)

Følgende sårspecifikke data vil blive indsamlet:

• Dage siden indlæggelse og indlæggelsesdage på afhentningsdagen (input er numerisk)
• Dage siden forbrændingsskade (input er numerisk)
• Antal operative indgreb under den aktuelle indlæggelse inklusive operationen på tidspunktet for prøvetagning (input er numerisk)
• Antal samlede operative indgreb i forbindelse med indeksforbrændingsskade, inklusive operationer udført på andre faciliteter, operationer udført ved tidligere indlæggelser på UTMB og operationen på tidspunktet for prøvetagning (input er numerisk)
• Kropsplacering, hvorfra prøven er indsamlet (kategorier er øvre ekstremitet enten arm eller hånd, underekstremitet enten ben eller fod, forreste thorax, posterior thorax eller hoved/hals). Væv fra kønsorganer og lyske vil ikke blive opsamlet.
• Total kropsoverfladeareal forbrændt (TBSA) procentdel som bestemt ved indlæggelse (input er numerisk)
• Bekymring for fuld tykkelse eller 3. grads forbrændingsskade fra det sted, hvor prøven bliver indsamlet (kategorierne er ja eller nej)
• Formodet type væv fra det sted, hvor prøven tages (kategorierne er kutan, subkutan eller myofascial)
• Ætiologi af forbrændingsskader (kategorier er flamme, skoldning, kontakt, kemisk, elektrisk eller andet)
• Antimikrobiel sårpleje umiddelbart før operation på såret fra med væv indsamles (kategorierne omfatter antibiotisk salve, Dakins' opløsningsskylning, sølvnitratskylning, mafenidacetat-skylning, amphotericinopblødning, sølvsulfadiazincreme, sølvbaseret syntetisk forbinding, ikke- sølvbaseret syntetisk forbinding).

BIOSTATISTIK

Vi foreslår at indsamle mindst 300 progenitor-prøver, der skal inkluderes i Bio-Repository for at analysere data for at besvare (mindst) følgende spørgsmål:

• Hvad er sammenhængen mellem NGS-forbrændingssårets mikrobiom og traditionelle dyrkningsteknikker?
• Hvad er den relative fordeling af mikrober i brandsåret?
• Hvad er den relative fordeling af mikrobeantal og koncentration i forbrændingssår sammenlignet med traditionelle teknikker?

Alle disse spørgsmål kan udelukkende besvares med afidentificerede kasserede prøver. For yderligere spørgsmål kan disse prøver med tilhørende kliniske og sårspecifikke data bruges til at besvare følgende:

• Giver patientens alder i år, forskellige forbrændingssårmikrobiom? Afspejles dette med klassiske kulturteknikker?
• Har køn nogen effekt på forbrændingssårets mikrobiom? Afspejles dette med klassiske kulturteknikker?
• Påvirker etnicitet brandsårets mikrobiom? Vægt og BMI? Graviditet? COVID-19? Forbrændingsstørrelse?
• Påvirker topisk og/eller systemisk antibiotikabrug brandsårets mikrobiom?
• Påvirker brandsårets alder brandsårets mikrobiom? Har antallet af tidligere eller efterfølgende operative indgreb nogen effekt?
• Har den skadede kropsregion nogen effekt på forbrændingssårets mikrobiom?

STATISTISK ANALYSE:

Beskrivende statistik for kontinuerte variable vil blive præsenteret som middel ± SD, og ​​for kategoriske variable som frekvenser og proportioner. Bivariat analyse vil omfatte korrelationstest med Pearson korrelationskoefficient, hvor normalitetsantagelsen ikke er overtrådt, og Spearmans rho, når normalitet ikke antages. Ved hjælp af flere lineære regressionsmodeller vil vi vurdere forholdet mellem NGS-forbrændingssårmikrobiom og traditionelle dyrkningsteknikker samt bestemme prædiktorerne for forbrændingssårmikrobiom i indsamlede bioprøver fra voksne forbrændingspatienter. Diagnostisk testning vil blive udført på de fulde multiple regressionsmodeller. Tosidet statistisk signifikans vil blive taget i betragtning for alfa på 0,01-niveau.

Effektanalyse: Effektanalyse for vores forudsigelsesmodel var baseret på en effektstørrelse f2 på 0,136 beregnet ud fra forventet r2 på 0,12 med 20 prædiktorer ved alfa=0,01 og for en potens af f-testen til at forkaste nulhypotesen ved 90 %. Prøvestørrelsen, der er nødvendig for en sådan model med 20 prædiktorer til at forklare mindst 12% af variationen på den afhængige variabel (brændingssårmikrobiom) ved 90% effekt og ved alfa=0,01 er 271 progenitorprøver. Vi sigter mod at indsamle 300 progenitorprøver for at tage højde for 10 % analytisk fejl. Vi brugte G*power (version 3.1.9.7) under f-testfamilien til at estimere denne foreslåede stikprøvestørrelse.