Comprensione del microbioma delle ferite da ustione: confronto tra le colture tradizionali delle ferite e la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione

1. - INTRODUZIONE: Il microbioma umano è costituito da microrganismi tra cui batteri, funghi, archaea e virus che vivono in associazione con il corpo. Nella persona media, i batteri da soli sono dieci volte più numerosi delle cellule ospiti e contengono un migliaio di geni in più rispetto al genoma umano. Pertanto, nonostante sia costituito da <3% della biomassa corporea, il microbioma umano svolge un ruolo cruciale nello stabilire e mantenere la complessa biomeccanica della nostra salute e del nostro sviluppo. Negli ultimi due decenni, il progetto NIH Human Microbiome ha messo in luce una serie di influenze recentemente scoperte che il microbioma ha sulla fisiologia umana (Turnbaugh et al., 2007). Nonostante i notevoli progressi compiuti negli ultimi due decenni, solo di recente si è iniziato a decifrare il diverso ecosistema del microbiota presente nelle ferite cutanee e la loro influenza sulla rigenerazione dell'ospite, sulla risposta immunitaria e sulla guarigione delle ferite. Ad oggi abbiamo solo una comprensione superficiale del microbioma della ferita da ustione e del suo impatto sull'infezione, l'infiammazione sistemica, la guarigione della ferita e, in ultima analisi, la prognosi del paziente.

2. - BACKGROUND: le ustioni gravi sono una delle principali fonti globali di morbilità e mortalità. Secondo il National Center for Injury Prevention and Control e l'American Burn Association, 450.000 pazienti soffrono di ustioni termiche ogni anno solo negli Stati Uniti; di quelli ricoverati per il trattamento, il 3% non sopravviverà principalmente a causa di infezione e sepsi. Dopo una grave ustione, il modello di colonizzazione microbica nelle ferite da ustione segue una sequenza relativamente prevedibile di supplementazione che inizia con batteri gram-positivi seguiti da batteri gram-negativi e successivamente da patogeni più virulenti. Diversi studi hanno dimostrato che la durata del ricovero è associata alle specie microbiche isolate dalle ustioni. Numerosi studi hanno esplorato il microbioma delle ferite cutanee croniche con risultati che suggeriscono che la guarigione è influenzata da popolazioni microbiche patologiche e benefiche. L'analisi della coltura microbiologica tradizionale è un surrogato dell'effettivo microbioma della ferita, ma non riesce a identificare l'intero respiro dell'ecosistema microbico presente nelle ferite da ustione, poiché molte specie sono difficili da coltivare in condizioni standard e l'ambiente di coltura stesso differisce sostanzialmente dall'ambiente della ferita. Inoltre, il microbioma della ferita è dinamico e mutevole influenzato da fattori ambientali, agenti per la cura della ferita, risposta immunitaria dell'ospite e farmaci. Inoltre, le tradizionali colture della ferita richiedono diversi giorni per essere finalizzate e nel corso di tale periodo potrebbero non riflettere più gli attuali residenti microbici della ferita stessa. Infine, molta attenzione è rivolta alle specie patogene note e ai ceppi multifarmacoresistenti (Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Enterobacteriaceae resistenti ai carbapenemi per citarne alcuni), ma la presenza e l'influenza delle specie benefiche è spesso trascurata.

   I metodi indipendenti dalla coltura che utilizzano la tecnologia Next Generation Sequencing (NGS), come il sequenziamento dell'amplicone 16S e 18S e il sequenziamento shotgun del metagenoma, si sono dimostrati più veloci e più sensibili rispetto alle colture microbiologiche tradizionali. La tecnologia 16S NGS utilizza 16S rDNA per codificare le sequenze di rRNA ribosomiale dei procarioti. All'interno della sequenza 16S rDNA sono presenti nove regioni variabili, che prendono di mira le differenze genetiche tra le specie batteriche. In modo simile, la tecnologia 18S NGS codifica per le sequenze di rRNA ribosomiale degli eucarioti e le regioni variabili vengono utilizzate per classificare le differenze di specie tra i microrganismi eucarioti in un campione.

3. - PROCEDURE DI STUDIO Raccolta di campioni e dati: il Bio-Repository/dati sulle ferite da ustione raccoglierà campioni biologici dai tessuti delle ferite da ustione asportati che saranno scartati dall'équipe chirurgica. Non saranno raccolti più di due campioni progenitori da ogni singolo caso operativo. Ogni esemplare sarà diviso al momento della raccolta in due sottocampioni che pesano ciascuno circa 0,5-2 grammi. Ogni campione deve provenire da una sola regione corporea specifica classificata come estremità superiori (braccio o mano), estremità inferiori (gamba o piede), torace anteriore, torace posteriore o testa/collo. Inoltre, non verranno prelevati campioni dai genitali o dal perineo a causa dell'elevato rischio di contaminazione dei campioni.

I sub-campioni saranno trasportati immediatamente su ghiaccio e temporaneamente conservati in un congelatore a -20ºC, quindi una porzione del tessuto (meno di 0,5 cm) verrà posta in RNAlater(R) RNA Stabilization Solution (RNAlater(R)) per per la conservazione/stabilizzazione dei nucleotidi. Il tessuto posto in RNAlater(R) sarà refrigerato a 4ºC durante la notte per consentire una sufficiente penetrazione del tessuto. Successivamente i campioni conservati saranno conservati a una temperatura compresa tra -20ºC e -80ºC. Questo processo verrà eseguito entro 1 ora dalla raccolta. Ogni sub-campione genererà due campioni aggiuntivi da inserire in RNAlater(R). Dopo il periodo iniziale di refrigerazione, i campioni di RNAlater(R) verranno conservati nel Secondo Bio-Deposito in un congelatore a -80ºC. I tessuti non utilizzati saranno etichettati con la stessa sequenza anonimizzata e codice a barre e conservati in un congelatore a -80ºC per un periodo non superiore a 12 mesi e non inferiore a 6 mesi (Primo Bio-Repository).

Per indirizzare l'altro sottocampione etichettato, verrà trasportato al Laboratorio di microbiologia clinica (CML) in una fiala di raccolta del campione da 15 ml per essere sottoposto ad analisi di coltura microbiologica. Dopo il completamento dell'analisi della coltura microbiologica, le colonie batteriche specifiche dalle piastre di coltura della LMC saranno isolate e processate in una soluzione di conservazione dei nucleotidi (RNAlater(R)). Analogamente alle loro controparti del Secondo Bio-Repository, i campioni verranno raggruppati per l'analisi NGS. Se sufficientemente raggruppati, i campioni del Terzo Bio-Repository saranno sottoposti all'estrazione di nucleotidi da parte del personale della struttura NGS prima dell'analisi NGS utilizzando l'analisi Shotgun Whole Genome Sequencing. I pazienti/LAR verranno contattati per il consenso informato dopo l'introduzione allo studio da parte del personale clinico e verrà confermato che sono accettabili ulteriori informazioni sul consenso informato. Una volta ottenuto il consenso informato firmato, i dati specifici della ferita clinicamente pertinenti saranno raccolti per il primo database sotto la stessa etichetta anonimizzata. Se non si ottiene il consenso informato, i campioni verranno eliminati e non considerati ulteriormente. Tutte le informazioni raccolte saranno collegate agli identificatori univoci anonimizzati, che saranno specifici per ciascun esemplare progenitore. Tutti i dati raccolti saranno indipendenti dalla cartella clinica e conservati in modo sicuro.

Saranno raccolti i seguenti dati specifici del paziente:

• Età del paziente in anni al momento della lesione da ustione (l'input è numerico in anni)
• Sesso del paziente al momento della lesione da ustione (le categorie sono Maschio, Femmina, Altro)
• Etnia del paziente (le categorie sono bianche, nere, ispaniche, asiatiche, native americane, isolane del Pacifico e altre)
• Peso e indice di massa corporea del paziente al momento dell'intervento (l'input è numerico)
• Stato di gravidanza (le categorie sono positive, negative o sconosciute)
• Stato COVID-19 (le categorie sono positive, negative o sconosciute)
• Antibiotici orali o EV ricevuti entro 24 ore dall'intervento (le categorie sono vancomicina, meropenem, daptomicina, Zosyn, doxiciclina, Ancef, Bactrim, Augmentin, qualsiasi antimicotico o qualsiasi antivirale)
• Classe di farmaci - domiciliari e ospedalieri (le categorie sono terapia diabetica, steroidi, immunoterapia o chemioterapia)
• Qualsiasi precedente sequenza anonimizzata associata al soggetto dall'attuale ricovero
• TBSA bruciato (l'input è numerico: % della superficie corporea totale)

Saranno raccolti i seguenti dati specifici della ferita:

• Giorni dal ricovero e giorni di degenza il giorno della raccolta (l'input è numerico)
• Giorni dall'ustione (l'input è numerico)
• Numero di interventi operativi durante l'attuale ricovero, compreso l'intervento chirurgico al momento della raccolta del campione (l'input è numerico)
• Numero di interventi operatori totali associati a lesioni da ustione da indice, comprese le operazioni eseguite in altre strutture, le operazioni eseguite in precedenti ricoveri all'UTMB e l'intervento chirurgico al momento della raccolta del campione (l'input è numerico)
• Posizione del corpo da cui viene prelevato il campione (le categorie sono estremità superiore braccio o mano, estremità inferiore gamba o piede, torace anteriore, torace posteriore o testa/collo). I tessuti dei genitali e dell'inguine non saranno raccolti.
• Percentuale della superficie corporea totale bruciata (TBSA) determinata al momento del ricovero (l'input è numerico)
• Preoccupazione per la profondità della lesione da ustione a tutto spessore o di 3° grado dal sito in cui viene raccolto il campione (le categorie sono sì o no)
• Tipo presunto di tessuto dal sito in cui viene prelevato il campione (le categorie sono cutaneo, sottocutaneo o miofasciale)
• Eziologia della lesione da ustione (le categorie sono fiamma, scottatura, contatto, chimica, elettrica o altro)
• Cura della ferita antimicrobica immediatamente prima dell'intervento chirurgico sulla ferita da cui viene raccolto il tessuto (le categorie includono unguento antibiotico, irrigazione con soluzione di Dakins, irrigazione con nitrato d'argento, irrigazione con acetato di mafenide, amfotericina, crema di sulfadiazina d'argento, medicazione sintetica a base d'argento, non- medicazione sintetica a base di argento).

BIOSTATISTICA

Proponiamo di raccogliere almeno 300 campioni progenitori da includere nel Bio-Repository per analizzare i dati per rispondere (almeno) alle seguenti domande:

• Qual è la correlazione tra il microbioma della ferita da ustione NGS e le tecniche di coltura tradizionali?
• Qual è la distribuzione relativa delle specie microbiche nella ferita da ustione?
• Qual è la distribuzione relativa del numero e della concentrazione dei microbi nelle ustioni rispetto alle tecniche tradizionali?

A tutte queste domande si può rispondere esclusivamente con campioni scartati anonimizzati. Per ulteriori domande, i campioni con i dati clinici e specifici della ferita associati possono essere utilizzati per rispondere a quanto segue:

• L'età in anni del paziente genera un diverso microbioma della ferita da ustione? Questo si riflette con le tecniche della cultura classica?
• Il genere ha qualche effetto sul microbioma delle ferite da ustione? Questo si riflette con le tecniche della cultura classica?
• L'etnia influisce sul microbioma della ferita da ustione? Peso e indice di massa corporea? Gravidanza? COVID 19? Brucia le dimensioni?
• L'uso topico e/o sistemico di antibiotici influisce sul microbioma della ferita da ustione?
• L'età della ferita da ustione influisce sul microbioma della ferita da ustione? Il numero di interventi chirurgici precedenti o successivi ha qualche effetto?
• La regione del corpo ferita ha qualche effetto sul microbioma della ferita da ustione?

ANALISI STATISTICA:

Le statistiche descrittive per le variabili continue saranno presentate come media ± SD e per le variabili categoriali come frequenze e proporzioni. L'analisi bivariata includerà il test di correlazione con il coefficiente di correlazione di Pearson in cui l'ipotesi di normalità non è violata e il rho di Spearman quando la normalità non è assunta. Utilizzando più modelli di regressione lineare, valuteremo la relazione tra il microbioma della ferita da ustione NGS e le tecniche di coltura tradizionali, nonché determineremo i predittori del microbioma della ferita da ustione nei campioni biologici raccolti da pazienti ustionati adulti. Verranno eseguiti test diagnostici sui modelli di regressione multipla completi. La significatività statistica bilaterale sarà considerata per l'alfa al livello 0,01.

Analisi della potenza: l'analisi della potenza per il nostro modello di previsione era basata su una dimensione dell'effetto f2 di 0,136 calcolata da r2 previsto di 0,12 con 20 predittori ad alfa=0,01 e per una potenza del test f per rifiutare l'ipotesi nulla al 90%. La dimensione del campione necessaria per un tale modello con 20 predittori per spiegare almeno il 12% della variazione sulla variabile dipendente (microbioma della ferita da ustione) al 90% di potenza e alfa=0,01 è di 271 campioni progenitori. Miriamo a raccogliere 300 campioni progenitori per tenere conto del 10% di fallimento analitico. Abbiamo utilizzato G*power (versione 3.1.9.7) nella famiglia di test f per stimare questa dimensione del campione suggerita.