Pochopení mikrobiomu popálenin: Porovnání tradičních kultur ran s technologií sekvenování nové generace

1. - ÚVOD: Lidský mikrobiom se skládá z mikroorganismů včetně bakterií, hub, archeí a virů, které žijí ve spojení s tělem. U průměrného člověka samotné bakterie převyšují hostitelské buňky desetinásobně a obsahují o tisíc více genů než lidský genom. Proto, přestože sestává z <3 % tělesné biomasy, lidský mikrobiom hraje klíčovou roli při vytváření a udržování komplexní biomechaniky našeho zdraví a rozvoje. V posledních dvou desetiletích projekt NIH Human Microbiome Project upozornil na řadu nově objevených vlivů, které má mikrobiom na lidskou fyziologii (Turnbaugh et al., 2007). Navzdory pozoruhodnému pokroku dosaženému v posledních dvou desetiletích se teprve nedávno začal dešifrovat rozmanitý ekosystém mikrobioty přítomný v kožních ranách a jejich vliv na regeneraci hostitele, imunitní odpověď a hojení ran. K dnešnímu dni máme pouze povrchní znalosti o mikrobiomu popálenin a jeho vlivu na infekci, systémový zánět, hojení ran a nakonec prognózu pacienta.

2. - SOUVISLOSTI: Těžké popáleniny jsou hlavním celosvětovým zdrojem nemocnosti a úmrtnosti. Podle National Center for Injury Prevention and Control and American Burn Association utrpí jen ve Spojených státech 450 000 pacientů každý rok tepelné popáleniny; z těch, kteří byli přijati k léčbě, 3 % nepřežijí většinou kvůli infekci a sepsi. Po těžkém popálení následuje vzorec mikrobiální kolonizace v popáleninách relativně předvídatelnou sekvenci suplementace počínaje grampozitivními bakteriemi následovanými gramnegativními bakteriemi a následně virulentnějšími patogeny. Několik studií ukázalo, že délka hospitalizace je spojena s mikrobiálními druhy izolovanými z popálenin. Řada studií zkoumala mikrobiom chronických kožních ran se zjištěními naznačujícími, že hojení je ovlivněno jak patologickými, tak prospěšnými mikrobiálními populacemi. Tradiční mikrobiologická kultivační analýza je náhradou za skutečný mikrobiom rány, ale nedokáže identifikovat plný dech mikrobiálního ekosystému přítomného v popáleninách, protože mnoho druhů je obtížné kultivovat za standardních podmínek a samotné kultivační prostředí se podstatně liší od prostředí rány. Kromě toho je mikrobiom rány dynamický a mění se ovlivněný faktory prostředí, látkami pro péči o rány, imunitní reakcí hostitele a léky. Dokončení tradičních kultur ran navíc trvá několik dní a během této doby již nemusí odrážet aktuální mikrobiální obyvatele samotné rány. V neposlední řadě je velká pozornost zaměřena na známé patogenní druhy a multirezistentní kmeny (Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Enterobacteriaceae rezistentní na karbapenem), ale přítomnost a vliv prospěšných druhů je často přehlížen.

   Metody nezávislé na kultuře využívající technologii Next Generation Sequencing (NGS), jako je sekvenování amplikonů 16S a 18S a sekvenování metagenomových brokovnic, se ukázaly být rychlejší a citlivější než tradiční mikrobiologické kultury. Technologie 16S NGS využívá 16S rDNA ke kódování ribozomálních rRNA sekvencí prokaryot. V sekvenci 16S rDNA je přítomno devět variabilních oblastí, které se zaměřují na genetické rozdíly mezi bakteriálními druhy. Podobným způsobem 18S NGS technologie kóduje ribozomální rRNA sekvence eukaryot a variabilní oblasti se používají ke klasifikaci druhových rozdílů mezi eukaryotickými mikroorganismy ve vzorku.

3. - POSTUPY STUDIE Sběr vzorků a dat: Úložiště dat popálených ran/Bio-úložiště bude shromažďovat biovzorky z vyříznutých tkání popálenin, aby je chirurgický tým zlikvidoval. Z každého jednotlivého operačního případu nebudou odebrány více než dva progenitorové vzorky. Každý vzorek bude v době odběru rozdělen na dva podvzorky, z nichž každý váží přibližně 0,5–2 gramy. Každý vzorek musí pocházet pouze z jedné specifické oblasti těla klasifikované jako horní končetiny (buď paže nebo ruka), dolní končetiny (buď noha nebo chodidlo), přední hrudník, zadní hrudník nebo hlava/krk. Kromě toho nebudou odebrány žádné vzorky z genitálií nebo perinea kvůli vysokému riziku kontaminace vzorku.

Dílčí vzorky budou okamžitě transportovány na ledu a dočasně uloženy v mrazáku -20 °C, poté bude část tkáně (méně než 0,5 cm) umístěna do RNAlater® RNA Stabilization Solution (RNAlater®) v pořadí pro konzervaci/stabilizaci nukleotidů. Tkáň umístěná v RNAlater(R) bude přes noc zchlazena na 4ºC, aby byla umožněna dostatečná penetrace tkání. Poté budou konzervované vzorky skladovány při -20ºC až -80ºC. Tento proces bude proveden do 1 hodiny od odběru. Každý dílčí vzorek vygeneruje dva další vzorky, které se umístí do RNAlater(R). Po počátečním období chlazení budou vzorky RNAlater(R) uloženy ve druhém biologickém úložišti v mrazáku -80ºC. Nepoužitá tkáň bude označena stejnou deidentifikovanou sekvencí a čárovým kódem a uložena v mrazáku -80ºC po dobu ne delší než 12 měsíců a ne méně než 6 měsíců (první bio-úložiště).

Aby bylo možné adresovat další označený podvzorek, bude přepraven do Laboratoře klinické mikrobiologie (CML) v 15ml lahvičce na odběr vzorků, kde bude provedena analýza mikrobiologické kultury. Po dokončení mikrobiologické kultivační analýzy budou specifické bakteriální kolonie z kultivačních ploten v CML izolovány a zpracovány v roztoku pro konzervaci nukleotidů (RNAlater(R)). Podobně jako jejich protějšky z druhého biologického úložiště budou vzorky dávkovány pro analýzu NGS. Po dostatečném dávkování budou vzorky ze třetího biologického úložiště podrobeny extrakci nukleotidů pracovníky zařízení NGS před analýzou NGS pomocí analýzy sekvenování celého genomu Shotgun. Pacienti/LAR budou osloveni s žádostí o informovaný souhlas po uvedení do studie klinickým personálem a bude potvrzeno, že více informací týkajících se informovaného souhlasu je přijatelné. Po obdržení podepsaného informovaného souhlasu budou klinicky relevantní data specifická pro ránu shromážděna pro první databázi pod stejným neidentifikovatelným štítkem. Pokud nebude získán informovaný souhlas, budou vzorky vyřazeny a nebudou dále brány v úvahu. Všechny shromážděné informace budou spojeny s neidentifikovatelnými jedinečnými identifikátory, které budou specifické pro každý progenitorový vzorek. Všechna shromážděná data budou nezávislá na klinickém záznamu a budou bezpečně uložena.

Budou shromažďovány následující údaje specifické pro pacienty:

• Věk pacienta v letech v době popáleninového poranění (vstup je číselný v letech)
• Pohlaví pacienta v době popáleninového poranění (kategorie jsou muži, ženy, jiné)
• Etnická příslušnost pacienta (kategorie jsou běloši, černoši, hispánci, Asiaté, indiáni, tichomořští ostrované a další)
• Hmotnost a BMI pacienta v době operace (vstup je číselný)
• Stav těhotenství (kategorie jsou pozitivní, negativní nebo neznámé)
• Stav COVID-19 (kategorie jsou pozitivní, negativní nebo neznámé)
• Perorální nebo IV antibiotika podaná do 24 hodin po operaci (kategorie jsou vankomycin, meropenem, daptomycin, Zosyn, doxycyklin, Ancef, Bactrim, Augmentin, jakékoli antimykotikum nebo jakékoli antivirotikum)
• Třída medikace – domácí a ústavní (kategorie jsou diabetická terapie, steroidy, imunoterapie nebo chemoterapie)
• Jakákoli předchozí neidentifikovaná sekvence spojená s předmětem z aktuálního přijetí
• Popálená TBSA (zadaná hodnota je číselná: % celkové plochy povrchu těla)

Budou shromažďována následující data specifická pro rány:

• Dny od přijetí a dny v nemocnici v den odběru (vstup je číselný)
• Dny od popálení (zadání je číselné)
• Počet operačních výkonů při aktuálním příjmu včetně operace v době odběru vzorku (vstup je číselný)
• Počet celkových operačních výkonů spojených s indexovým popáleninovým poraněním včetně operací provedených na jiných pracovištích, operací provedených při předchozích přijetích na UTMB a operací v době odběru vzorku (vstup je číselný)
• Umístění těla, ze kterého je vzorek odebrán (kategorie jsou horní končetina buď paže nebo ruka, dolní končetina buď noha nebo noha, přední hrudník, zadní hrudník nebo hlava/krk). Tkáně z genitálií a třísel nebudou odebírány.
• Procento celkového spáleného tělesného povrchu (TBSA) stanovené při přijetí (vstup je číselný)
• Obavy o plnou tloušťku nebo hloubku popálenin 3. stupně z místa odběru vzorku (kategorie jsou ano nebo ne)
• Předpokládaný typ tkáně z místa odběru vzorku (kategorie jsou kožní, subkutánní nebo myofasciální)
• Etiologie popáleninového poranění (kategorie jsou plamen, opaření, kontakt, chemické, elektrické nebo jiné)
• Antimikrobiální péče o rány bezprostředně před operací na ráně s tkání se shromažďuje (kategorie zahrnují antibiotickou mast, irigaci Dakinsovým roztokem, irigaci dusičnanem stříbrným, irigaci mafenidacetátem, amfotericinové namáčení, stříbrný sulfadiazinový krém, syntetický obvaz na bázi stříbra, ne syntetický obvaz na bázi stříbra).

BIOSTISTIKA

Navrhujeme shromáždit alespoň 300 vzorků progenitorů, které zahrneme do Bio-úložiště, abychom analyzovali data, abychom odpověděli (alespoň) na následující otázky:

• Jaká je korelace mezi mikrobiomem popálenin NGS a tradičními kultivačními technikami?
• Jaká je relativní distribuce druhů mikrobů v popálené ráně?
• Jaká je relativní distribuce počtu a koncentrace mikrobů v popáleninách ve srovnání s tradičními technikami?

Všechny tyto otázky lze zodpovědět pouze pomocí neidentifikovaných vyřazených vzorků. Pro další otázky lze vzorky s přidruženými klinickými údaji a údaji specifickými pro ránu použít k zodpovězení následujících otázek:

• Způsobuje věk v letech pacienta odlišný mikrobiom popálenin? Odráží se to v technikách klasické kultury?
• Má pohlaví nějaký vliv na mikrobiom popálenin? Odráží se to v klasických kulturních technikách?
• Ovlivňuje etnický původ mikrobiom popálenin? Váha a BMI? Těhotenství? COVID 19? Velikost popálenin?
• Ovlivňuje lokální a/nebo systémové použití antibiotik mikrobiom popálenin?
• Má věk popáleniny vliv na mikrobiom popáleninové rány? Má počet předchozích nebo následných operačních zákroků nějaký vliv?
• Má poraněná oblast těla nějaký vliv na mikrobiom popálenin?

STATISTICKÁ ANALÝZA:

Popisná statistika pro spojité proměnné bude prezentována jako průměr ± SD a pro kategorické proměnné jako frekvence a podíly. Dvourozměrná analýza bude zahrnovat korelační testování s Pearsonovým korelačním koeficientem, kde není porušen předpoklad normality, a Spearmanovo rho, když se normalita nepředpokládá. Pomocí vícenásobných lineárních regresních modelů posoudíme vztah mezi mikrobiomem popálenin NGS a tradičními kultivačními technikami a také určíme prediktory mikrobiomu popálenin v odebraných biovzorcích od dospělých pacientů s popáleninami. Diagnostické testování bude provedeno na úplných vícenásobných regresních modelech. Pro alfa na hladině 0,01 bude uvažována oboustranná statistická významnost.

Analýza síly: Analýza síly pro náš predikční model byla založena na velikosti účinku f2 0,136 vypočítané z předpokládané r2 0,12 s 20 prediktory při alfa=0,01 a na síle f testu k zamítnutí nulové hypotézy na 90 %. Velikost vzorku potřebná pro takový model s 20 prediktory k vysvětlení alespoň 12 % variace na závislé proměnné (mikrobiom popálené rány) při 90% síle a při alfa=0,01 je 271 progenitorových vzorků. Naším cílem je shromáždit 300 vzorků progenitorů, abychom odpovídali 10% analytickému selhání. K odhadu navrhované velikosti vzorku jsme použili G*power (verze 3.1.9.7) v rámci rodiny f testů.