了解烧伤伤口微生物组：传统伤口培养与下一代测序技术的比较

1. - 简介：人类微生物组由微生物组成，包括与身体相关的细菌、真菌、古细菌和病毒。 在普通人身上，单是细菌的数量就比宿主细胞多十倍，并且包含的​​基因比人类基因组多一千个。 因此，尽管人体微生物组的生物量不到 3%，但它在建立和维持我们健康和发展的复杂生物力学方面发挥着至关重要的作用。 在过去的二十年中，NIH 人类微生物组计划重点关注了微生物组对人类生理学的许多新发现影响（Turnbaugh 等人，2007 年）。 尽管在过去二十年取得了显着进展，但皮肤伤口中存在的微生物群的多样化生态系统及其对宿主再生、免疫反应和伤口愈合的影响直到最近才开始被破译。 迄今为止，我们对烧伤伤口微生物组及其对感染、全身炎症、伤口愈合和最终患者预后的影响只有肤浅的了解。

2. - 背景：严重烧伤是全球发病率和死亡率的主要来源。 根据国家伤害预防和控制中心和美国烧伤协会的数据，仅在美国，每年就有 45 万名患者遭受热烧伤；在接受治疗的患者中，3% 的患者主要由于感染和败血症而无法存活。 严重烧伤后，烧伤创面的微生物定植模式遵循相对可预测的补充顺序，从革兰氏阳性菌开始，然后是革兰氏阴性菌，然后是毒性更强的病原体。 几项研究表明，住院时间长短与从烧伤伤口中分离出的微生物种类有关。 许多研究探索了慢性皮肤伤口的微生物组，结果表明愈合受到病理和有益微生物种群的影响。 传统的微生物学培养分析是对实际伤口微生物组的替代，但无法识别烧伤伤口中存在的微生物生态系统的全部呼吸，因为许多物种在标准条件下难以培养，而且培养环境本身与伤口环境有很大不同。 此外，伤口微生物组是动态的，并且受环境因素、伤口护理剂、宿主免疫反应和药物的影响而变化。 此外，传统的伤口培养需要几天时间才能完成，并且在这段时间内可能不再反映伤口本身当前的微生物居民。 最后，大量注意力集中在已知的致病菌种和多重耐药菌株（铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、耐碳青霉烯类肠杆菌科等）上，但有益菌种的存在和影响往往被忽视。

   使用下一代测序 (NGS) 技术的培养独立方法，例如 16S 和 18S 扩增子测序和宏基因组鸟枪法测序，已被证明比传统微生物学培养更快、更灵敏。 16S NGS 技术利用 16S rDNA 编码原核生物的核糖体 rRNA 序列。 16S rDNA 序列中存在九个可变区，其针对细菌物种之间的遗传差异。 以类似的方式，18S NGS 技术编码真核生物的核糖体 rRNA 序列，可变区用于对样品中真核微生物之间的物种差异进行分类。

3. - 研究程序标本和数据收集：烧伤数据/生物库将从切除的烧伤组织中收集生物标本，由外科团队丢弃。 从任何个体手术病例中收集的祖细胞标本不超过两个。 每个标本在收集时将分成两个子样本，每个子样本重约 0.5-2 克。 每个标本必须仅来自一个特定的身体区域，分类为上肢（手臂或手）、下肢（腿或脚）、前胸、后胸或头/颈。 此外，由于标本污染的风险很高，因此不会从生殖器或会阴部采集标本。

子样本将立即在冰上运输并暂时储存在-20ºC冰箱中，然后将一部分组织（小于0.5 cm）放入RNAlater(R) RNA Stabilization Solution（RNAlater(R)）中，以便用于核苷酸保存/稳定。 放置在 RNAlater(R) 中的组织将在 4ºC 下冷藏过夜，以允许足够的组织渗透。 之后保存的标本将储存在-20ºC至-80ºC。 此过程将在收集后 1 小时内执行。 每个子样本将生成两个额外的样本，放置在 RNAlater(R) 中。 在最初的冷藏期结束后，RNAlater(R) 标本将被储存在第二个生物储存库的 -80ºC 冰箱中。 未使用的组织将使用相同的去识别化序列和条形码进行标记，并在-80ºC 的冰箱中保存不超过 12 个月且不少于 6 个月的时间（First Bio-Repository）。

对于其他标记的子样本，将用 15mL 样本收集瓶运送到临床微生物学实验室 (CML) 进行微生物培养分析。 微生物学培养分析完成后，CML 培养板上的特定细菌菌落将被分离并在核苷酸保存溶液 (RNAlater(R)) 中进行处理。 与第二生物资源库的样本类似，样本将被分批进行 NGS 分析。 当批次足够时，来自第三生物库的标本将由 NGS 设施工作人员进行核苷酸提取，然后再使用鸟枪法全基因组测序分析进行 NGS 分析。 在临床工作人员介绍研究并确认有关知情同意的更多信息是可接受的之后，将接触患者/LAR 以获得知情同意。 一旦获得签署的知情同意书，将在相同的去识别标签下为第一个数据库收集临床相关的伤口特异性数据。 如果未获得知情同意，标本将被丢弃，不再考虑。 所有收集的信息都将链接到去识别化的唯一标识符，这些标识符将特定于每个祖细胞标本。 所有收集的数据都将独立于临床记录并安全存储。

将收集以下患者特定数据：

• 烧伤时患者的年龄（以年为单位输入）
• 烧伤时患者的性别（类别为男性、女性、其他）
• 患者的种族（类别为白人、黑人、西班牙裔、亚裔、美洲原住民、太平洋岛民等）
• 手术时患者的体重和 BMI（输入为数字）
• 妊娠状态（类别为阳性、阴性或未知）
• COVID-19 状态（类别为阳性、阴性或未知）
• 手术后 24 小时内接受口服或静脉注射抗生素（类别为万古霉素、美罗培南、达托霉素、Zosyn、多西环素、Ancef、Bactrim、Augmentin、任何抗真菌药或任何抗病毒药）
• 药物类——家庭和住院（类别是糖尿病治疗、类固醇、免疫治疗或化疗）
• 当前入场时与受试者相关的任何先前的去识别化序列
• TBSA 燃烧（输入数字：% 总表面积）

将收集以下特定于伤口的数据：

• 入院天数和采集当天住院天数（输入数字）
• 烧伤后的天数（输入数字）
• 本次入院期间的手术干预次数，包括标本采集时的手术次数（输入为数值）
• 与指数烧伤相关的总手术干预次数，包括在其他设施进行的手术、之前入院 UTMB 时进行的手术以及标本采集时的手术（输入为数字）
• 采集标本的身体位置（类别是上肢，手臂或手，下肢，腿或脚，前胸，后胸或头/颈）。 不会收集生殖器和腹股沟的组织。
• 入院时确定的全身烧伤表面积 (TBSA) 百分比（输入为数字）
• 关注采集标本部位的全层烧伤深度或 3 度烧伤深度（类别为是或否）
• 采集标本部位的假定组织类型（类别为皮肤、皮下或肌筋膜）
• 烧伤的病因学（类别为火焰、烫伤、接触、化学、电气或其他）
• 正在收集组织伤口手术前的抗菌伤口护理（类别包括抗生素软膏、Dakins 溶液冲洗、硝酸银冲洗、mafenide 醋酸盐冲洗、两性霉素浸泡、磺胺嘧啶银乳膏、银基合成敷料、非银基合成敷料）。

生物统计学

我们提议收集至少 300 个祖细胞样本以包含在生物资源库中以分析数据以回答（至少）以下问题：

• NGS 烧伤创面微生物组与传统培养技术之间有何相关性？
• 烧伤创面微生物种类的相对分布是怎样的？
• 与传统技术相比，烧伤创面微生物数量和浓度的相对分布情况如何？

所有这些问题都可以仅通过去标识化的废弃样本来回答。 对于其他问题，那些具有相关临床和伤口特定数据的样本可用于回答以下问题：

• 患者的年龄是否会产生不同的烧伤创面微生物组？ 这是否反映在古典文化技术中？
• 性别对烧伤伤口微生物组有影响吗？ 这是否反映在经典的文化技术中？
• 种族会影响烧伤伤口微生物组吗？ 体重和体重指数？怀孕？ 新冠肺炎？ 燃烧大小？
• 局部和/或全身使用抗生素会影响烧伤伤口微生物组吗？
• 烧伤创面的年龄会影响烧伤创面的微生物组吗？ 之前或之后的手术干预次数是否有影响？
• 受伤的身体部位对烧伤创面微生物组有影响吗？

统计分析：

连续变量的描述性统计数据将以均值±标准差表示，分类变量的描述性统计数据将以频率和比例表示。 双变量分析将包括在不违反正态性假设的情况下使用 Pearson 相关系数的相关性测试，以及在不假设正态性时使用 Spearman 的 rho。 使用多元线性回归模型，我们将评估 NGS 烧伤创面微生物组与传统培养技术之间的关系，并确定从成年烧伤患者收集的生物样本中烧伤创面微生物组的预测因子。 将对完整的多元回归模型执行诊断测试。 对于 0.01 水平的 alpha，将考虑双边统计显着性。

功效分析：我们的预测模型的功效分析基于 0.136 的效应大小 f2，根据 0.12 的预期 r2 计算得出，20 个预测变量为 alpha = 0.01，并且 f 检验的功效在 90% 时拒绝原假设。 这种具有 20 个预测变量的模型在 90% 功效和 alpha = 0.01 时解释因变量（烧伤微生物组）至少 12% 的变异所需的样本量是 271 个祖细胞样本。 我们的目标是收集 300 个祖细胞样本以解释 10% 的分析失败。 我们使用 f 检验系列下的 G*power（版本 3.1.9.7）来估计建议的样本量。