Zbadaj ekspresję aneksyny A1 i jej potencjalne zastosowanie jako markera prognostycznego w raku jamy ustnej

MATERIAŁ I METODY

Po zatwierdzeniu przez Hospital Review Board uzyskaliśmy utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie próbki od 115 pacjentów z pierwotnym SCC jamy ustnej i 66 pacjentów z zaburzeniami erekcji jamy ustnej w Departamencie Patologii National Taiwan University Hospital, Taipei, Tajwan. Rozpoznanie SCC i ED w jamie ustnej oparto na badaniu histologicznym skrawków tkankowych barwionych hematoksyliną i eozyną. Wszyscy pacjenci zostali poddani całkowitemu chirurgicznemu wycięciu zmian w Klinice Chirurgii Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej lub Klinice Otolaryngologii Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Tajwanu w okresie od 1997 do 2004 roku. Próbki uzyskano z biopsji nacięcia lub całkowitego chirurgicznego wycięcia zmian. Jeśli węzły chłonne zostały zdiagnozowane jako dodatnie w kierunku SCC, w protokole leczenia uwzględniono również sekcję szyi i radioterapię pooperacyjną. Żaden pacjent nie otrzymał żadnej terapii przeciwnowotworowej przed wstępną biopsją. Szczegóły dotyczące nawyków ustnych pacjentów, w tym dziennego spożycia AQ, papierosów i alkoholu, a także czasu trwania tych nawyków, zostały również zapisane w karcie medycznej. Dwadzieścia próbek biopsyjnych normalnej błony śluzowej jamy ustnej (NOM) uzyskano od osób nie przeżuwających AQ i niepalących podczas ekstrakcji zatrzymanych stałych trzecich zębów trzonowych po uzyskaniu świadomej zgody i użyto ich jako zdrowych kontroli.

Hodowla komórkowa Zmodyfikowana przez Dulbecco pożywka Eagle'a (DMEM) i płodowa surowica bydlęca (FBS) zostały zakupione od Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). PD98059, Ly294002, SB203580 i czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) były produktami firmy Sigma (St Louis, MO, USA). Przeciwciało monoklonalne anty-ANX-1 zakupiono od BD Biosciences (Lexington, KY, USA). Hodowla komórkowa Komórki SAS utrzymywano w DMEM uzupełnionym 10% inaktywowanym termicznie FBS, penicyliną (100 UAmL)1) i streptomycyną (100 lgAmL)1) w 37 o C w atmosferze 5% CO2. Do analizy Western blot komórki wysiano na 10 cm szalki w ilości 2 x 106 komórek na szalkę. Po 18-24 godzinach komórki dalej hodowano w tej samej pożywce uzupełnionej bez FBS przez 24 godziny. Komórki pozbawione surowicy traktowano HGF we wskazanych czasach. Do barwienia immunologicznego 2 x 105 komórek hodowanych na szkiełkach nakrywkowych (22 x 22 mm) głodzono przez 24 godziny przed stymulacją HGF.

Wstępne traktowanie PD098059, Ly294002 i SB203580. Komórki wysiano przez noc w kompletnej pożywce, a następnie przemyto. Komórki hodowane w DMEM bez surowicy traktowano wstępnie 50 M PD098059 (inhibitor ERK), 30 M Ly294002 (inhibitor kinazy PI-3) i 20 M SB203580 (inhibitor p38) odpowiednio 3 godziny, a następnie traktowano je 40 ng HGF przez 3 godziny. Komórki sprawdzono metodą immunohistochemiczną i Western blot z przeciwciałem ANXA1.

Immunocytochemia (IHC) Próbki guza utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie oceniono pod kątem ekspresji aneksyny A1. Procedury IHC zastosowano jako odniesienie18, monoklonalne pierwszorzędowe przeciwciało anty-aneksyna AI (rozcieńczenie 1:600), skierowane przeciwko N- koniec aneksyny 1 uzyskano ze źródła sygnału (BD Biosciences). Translokacja białek określona przez dwóch patologów (Jeng i Lin) za pomocą immunohistochemii została oceniona jako ujemna (ocena 0), pozytywna (ocena 1), a ekspresja białek cytoplazmatycznych została oceniona jako ujemna (ocena 0), słaba (ocena 1), umiarkowana (ocena 2) lub silny (ocena 3) przy użyciu systemu, który został wcześniej zwalidowany.

Komórki SAS hodowane na szkiełkach nakrywkowych utrwalano 3,7% paraformaldehydem przez 15 minut i przepuszczano 0,2% Triton X-100 w PBS (0,58 M Na2HPO4, 0,17 M Na H2PO4, 0,68 M NaCl, pH = 7,4) (PBST) przez 5 minut . Po trzykrotnym przemyciu komórek PBST, komórki blokowano przez 30 minut w PBS zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej. Immunobarwienie przeprowadzono przez inkubację z przeciwciałem monoklonalnym anty-ANX-1 (rozcieńczenie 1:800) przez 2 godziny. Po trzykrotnym przemyciu komórek PBST, komórki inkubowano z króliczym anty-(mysim IgG) Ig skoniugowanym z TRITC przez 1 godzinę. Szkiełka nakrywkowe przemyto PBST, zamontowano i zbadano za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Wetzlar GmBH, Niemcy).

Frakcjonowanie komórek Komórki SAS wysiano na 10 cm szalki w ilości 2x106 komórek/szalkę i hodowano w DMEM przez 18-24 godzin. Komórki głodzono przez 24 godziny w pożywce bez surowicy. Po potraktowaniu HGF przez określony czas, komórki zebrano i przemyto lodowatym PBS. Następnie komórki ponownie zawieszono w 100 µl buforu do lizy (10 mM Hepes, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1% NP-40, 0,5 mM uorek fenylometylosulfonylu, 0,1 mM ditiotreitol, 0,1 mM ortowanadan sodu i proteaza inhibitory) i inkubowano na lodzie przez 10 min. Jądra zebrano przez wirowanie przy 2000 g przez 5 min w 4 o C. Supernatant zebrano jako frakcję cytozolową. Określono stężenie białka w każdej próbce.

Ocena ekspresji białka aneksyny A1 Rozkłady ekspresji ANXA1 w czterech kategoriach (0-25%, 26-50%, 51-75% i 76-100%) z translokacją jądrową zostały po raz pierwszy wykazane na podstawie parametrów kliniczno-patologicznych jamy ustnej ED i SCC a korelacje między średnimi poziomami ekspresji a tymi kliniczno-patologicznymi parametrami były dalej badane przy użyciu ANOVA. Metodę limitu produktu Kaplana-Meiera zastosowano do oceny prognostycznego znaczenia barwienia jądra ANXA1 w komórkach nowotworowych, jak również innych parametrów kliniczno-patologicznych. Porównanie skumulowanego przeżycia między grupami przeprowadzono za pomocą testu log-rank z programem Statistica (StatSoft Inc., USA). Analizy wielu zmiennych przeprowadzono za pomocą modelu regresji Coxa, aby ocenić dodatkowe wartości prognostyczne różnych zmiennych przy użyciu SAS 8.0 (SAS Institute Inc., USA). Wartość P mniejsza niż 0,05 uznano za istotną statystycznie.