研究膜联蛋白 A1 的表达及其作为口腔癌预后标志物的潜在用途

材料与方法

经医院审查委员会批准后，我们​​在台湾台北国立台湾大学医院病理科获得了 115 名原发性口腔 SCC 患者和 66 名口腔 ED 患者的福尔马林固定、石蜡包埋标本。 口腔 SCC 和 ED 的诊断基于苏木精和伊红染色组织切片的组织学检查。 所有患者于1997年至2004年期间在台大医院口腔颌面外科或耳鼻喉科接受病灶全切除术。 标本取自切口活检或病灶的全手术切除。 如果淋巴结被诊断为 SCC 阳性，则治疗方案中还包括颈清扫术和术后放疗。 在初始活检之前，没有患者接受过任何癌症治疗。 病历中还记录了患者口腔习惯的详细信息，包括每天摄入的 AQ、香烟和酒精以及这些习惯的持续时间。 在获得知情同意后，在拔除阻生下第三磨牙期间，从非 AQ 咀嚼者和非吸烟者那里获得了 20 个正常口腔粘膜 (NOM) 活检标本，并用作健康对照。

细胞培养 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 和胎牛血清 (FBS) 购自 Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA)。 PD98059、Ly294002、SB203580 和肝细胞生长因子 (HGF) 是 Sigma (St Louis, MO, USA) 的产品。 抗 ANX-1 单克隆抗体购自 BD Biosciences（列克星敦，肯塔基州，美国）。 细胞培养 SAS 细胞在补充有 10% 热灭活胎牛血清、青霉素 (100 UAmL)1) 和链霉素 (100 lgAmL)1) 的 DMEM 中维持在 37 o C、5% CO2 气氛下。 对于蛋白质印迹分析，将细胞以每盘 2 x 106 个细胞的密度接种到 10 厘米的盘中。 18-24 小时后，细胞在不含 FBS 的相同培养基中进一步生长 24 小时。 在指定的时间用 HGF 处理血清饥饿的细胞。 对于免疫染色，在用 HGF 刺激之前，将在盖玻片 (22 x 22 mm) 上生长的 2 x 105 个细胞饥饿 24 小时。

用 PD098059、Ly294002 和 SB203580 预处理细胞在完全培养基中铺板过夜，然后洗涤。 将在无血清 DMEM 中培养的细胞用 50M PD098059（ERK 抑制剂）、30M Ly294002（PI-3 激酶抑制剂）和 20M SB203580（p38 抑制剂）预处理分别3小时，然后用40ng HGF处理3小时。 通过免疫组织化学和使用 ANXA1 抗体的蛋白质印迹检查细胞。

免疫细胞化学 (IHC) 评估福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样本的膜联蛋白 A1 表达。遵循 IHC 程序作为参考18，单克隆一抗抗膜联蛋白 AI（1:600 稀释），针对 N-膜联蛋白 1 的末端是从信号源 (BD Biosciences) 获得的。 由两位病理学家（Jeng 和 Lin）使用免疫组织化学确定的蛋白质易位评分为阴性（0 分）、阳性（1 分），细胞质蛋白表达评分为阴性（0 分）、弱（1 分）、中度（评分2)，或强（得分 3）使用之前已经过验证的系统。

在盖玻片上生长的 SAS 细胞用 3.7% 多聚甲醛固定 15 分钟，并用 PBS 中的 0.2% Triton X-100（0.58M Na2HPO4、0.17 M Na H2PO4、0.68 M NaCl，pH=7.4）（PBST）透化 5 分钟. PBST洗涤细胞3次后，细胞在含1%牛血清白蛋白的PBS中封闭30 min。 通过与抗 ANX-1 单克隆抗体（1:800 稀释）孵育 2 小时进行免疫染色。 用PBST洗涤细胞3次后，将细胞与TRITC缀合的兔抗（小鼠IgG）Ig孵育1小时。 盖玻片用 PBST 清洗、固定并使用 Leica TCS SP2 共聚焦显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar GmBH，德国）进行检查。

细胞分级 将 SAS 细胞以 2x 106 个细胞/培养皿接种到 10cm 培养皿中，并在 DMEM 中培养 18-24 小时。 细胞在无血清培养基中饥饿 24 小时。 在用 HGF 处理给定时间后，收获细胞并用冰冷的 PBS 洗涤。 然后将细胞重悬于 100 μL 裂解缓冲液（10 mM Hepes、10 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1% NP-40、0.5 mM 苯甲基磺酰氟、0.1 mM 二硫苏糖醇、0.1 mM 原钒酸钠和蛋白酶）中抑制剂）并在冰上孵育 10 分钟。 通过在 4 o C 下以 2000 g 离心 5 分钟收集细胞核。收集上清液作为胞质部分。 测定每个样品的蛋白质浓度。

annexin A1 蛋白表达的评价首先通过口腔 ED 和 SCC 的临床病理参数显示 ANXA1 表达分布在四类（0-25%、26-50%、51-75% 和 76-100%）与核转位并且使用方差分析进一步检查平均表达水平与这些临床病理学参数之间的相关性。 Kaplan-Meier 乘积限值法用于评估癌细胞中 ANXA1 核染色的预后意义以及其他临床病理学参数。 使用 Statistica 程序（StatSoft Inc.，USA）的对数秩检验进行组间累积存活率的比较。 使用 Cox 回归模型进行多变量分析，以使用 SAS 8.0（SAS Institute Inc.，USA）评估不同变量的额外预后值。 小于 0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。