Undersøg udtrykket af Annexin A1 og dets potentielle brug som en prognostisk markør i oral cancer

MATERIALER OG METODER

Efter godkendelse fra Hospital Review Board fik vi formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver fra 115 patienter med primær oral SCC og 66 patienter med oral ED på Department of Pathology, National Taiwan University Hospital, Taipei, Taiwan. Diagnose af oral SCC og ED var baseret på histologisk undersøgelse af hæmatoxylin og eosin-farvede vævssnit. Alle patienter modtog total kirurgisk udskæring af læsionerne på afdelingen for oral og kæbekirurgi eller afdelingen for otolaryngologi, National Taiwan University Hospital i perioden fra 1997 til 2004. Prøver blev taget fra enten incisionsbiopsier eller total kirurgisk udskæring af læsionerne. Hvis lymfeknuder blev diagnosticeret som positiv for SCC, blev nakkedissektion og postoperativ strålebehandling også inkluderet i behandlingsprotokollen. Ingen patient havde modtaget kræftbehandling før de første biopsier. Detaljer om patienternes orale vaner, herunder dagligt forbrug af AQ'er, cigaretter og alkohol samt varigheden af ​​disse vaner, blev også registreret i det medicinske diagram. Tyve biopsiprøver af normal oral slimhinde (NOM) blev opnået fra ikke-AQ-tyggere og ikke-rygere under ekstraktion af angrebne permanente nedre tredje kindtænder efter at have opnået informeret samtykke, og brugt som de raske kontroller.

Cellekultur Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) og føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). PD98059, Ly294002, SB203580 og hepatocytvækstfaktor (HGF) var produkter fra Sigma (St Louis, MO, USA). Anti-ANX-1 monoklonalt antistof blev købt fra BD Biosciences (Lexington, KY, USA). Cellekultur SAS-celler blev holdt i DMEM suppleret med 10 % varmeinaktiveret FBS, penicillin (100 UAmL)1) og streptomycin (100 lgAmL)1) ved 37 o C under 5 % CO2-atmosfære. Til Western blot-analyse blev celler podet i 10 cm skåle med 2 x 106 celler pr. skål. Efter 18-24 timer blev cellerne yderligere dyrket i det samme medium suppleret uden FBS i 24 timer. Serum-udsultede celler blev behandlet med HGF i de angivne tider. Til immunfarvning blev 2 x 105 celler dyrket på dækglas (22 x 22 mm) udsultet i 24 timer før stimulering med HGF.

Forbehandling med PD098059, Ly294002 og SB203580 Cellerne blev udpladet natten over i komplet medium og derefter vasket. Cellerne dyrket i serumfrit DMEM blev forbehandlet med 50M PD098059 (hæmmer af ERK), 30 M Ly294002 (inhibitor af PI-3 kinase) og 20 M SB2035 for p0(8)8-inhibitor 3 timer, og derefter blev de behandlet med 40 ng HGF i 3 timer. Cellerne blev kontrolleret ved immunhistokemi og Western blot med ANXA1-antistof.

Immuncytokemi(IHC) Formalinfikserede, paraffinindlejrede tumorprøver blev vurderet for annexin A1-ekspression. IHC-procedurerne blev fulgt som reference18, Det monoklonale primære antistof anti-Annexin AI(1:600 ​​fortynding), rettet mod N- terminus af annexin 1 blev opnået fra en signalkilde (BD Biosciences). Proteintranslokation som bestemt af to patologer (Jeng og Lin) ved hjælp af immunhistokemi blev scoret som negativ (score 0), positiv (score 1), og cytoplasmatisk proteinekspression blev scoret som negativ (score 0), svag (score 1), moderat (score). 2), eller stærk (score 3) ved hjælp af et system, der tidligere er blevet valideret.

SAS-celler dyrket på dækglas blev fikseret med 3,7 % paraformaldehyd i 15 minutter og permeabiliseret med 0,2 % Triton X-100 i PBS (0,58 M Na2HPO4, 0,17 M Na H2PO4, 0,68 M NaCl, pH=7,4) (PBST) i 5 min. . Efter vask af cellerne med PBST tre gange blev cellerne blokeret i 30 minutter i PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin. Immunfarvning blev udført ved inkubation med anti-ANX-1 monoklonalt antistof (1:800 fortynding) i 2 timer. Efter vask af cellerne med PBST tre gange blev cellerne inkuberet med TRITC-konjugeret kanin anti-(muse IgG) Ig i 1 time. Dækglas blev vasket med PBST, monteret og undersøgt ved anvendelse af et Leica TCS SP2 Confocal mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar GmBH, Tyskland).

Cellefraktionering SAS-celler blev podet i 10 cm skåle med 2 x 106 celler/skål og dyrket i DMEM i 18-24 timer. Cellerne blev udsultet i 24 timer i serumfrit medium. Efter behandling med HGF i et givet tidsrum blev cellerne høstet og vasket med iskold PBS. Cellerne blev derefter resuspenderet i 100 µl lysisbuffer (10 mM Hepes, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 % NP-40, 0,5 mM phenylmethylsulfonyluorid, 0,1 mM dithiothreitatol, 0,1 mM dithiothreitatol, orthiothreitol, 0,1 mM sodiumhovanatol, 0,0. inhibitorer) og inkuberet på is i 10 min. Kernerne blev opsamlet ved centrifugering ved 2000 g i 5 minutter ved 4°C. Supernatanten blev opsamlet som en cytosolisk fraktion. Proteinkoncentrationen af ​​hver prøve blev bestemt.

Evaluering af annexin A1-proteinekspression Fordelingerne af ANXA1-ekspression i fire kategorier (0-25%, 26-50%, 51-75% og 76-100%) med nuklear translokation blev først vist af klinisk-patologiske parametre for oral ED og SCC'er og korrelationerne mellem gennemsnitlige ekspressionsniveauer og disse klinisk-patologiske parametre blev yderligere undersøgt ved anvendelse af ANOVA. Kaplan-Meier-produktgrænsemetoden blev brugt til at vurdere den prognostiske betydning af ANXA1 nuklear farvning i cancerceller såvel som andre klinisk-patologiske parametre. Sammenligning af kumulativ overlevelse mellem grupper blev udført ved hjælp af log-rank test med Statistica-programmet (StatSoft Inc., USA). Multivariable analyser blev udført med Cox regressionsmodel for at vurdere yderligere prognostiske værdier af de forskellige variable ved hjælp af SAS 8.0 (SAS Institute Inc., USA). En P-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.