Rola mikrocząstek w koagulopatii ostrej białaczki promielocytowej

Badacze planują zmierzyć rutynowe parametry laboratoryjne krzepnięcia i fibrynolizy, aktywność prokoagulacyjną lub profibrynolityczną mikrocząstek (MPs) oraz zbadać rolę prokoagulacyjnego i profibrynolitycznego czynnika aktywującego MPs w patogenezie koagulopatii u pacjentów z APL.

I. Dynamiczna turbidymetria tworzenia się skrzepów w osoczu. Wpływ MP na kinetykę tworzenia fibryny i właściwości optyczne skrzepów bada się za pomocą dynamicznej turbidymetrii ponownie uwapnionych próbek osocza (osocza bezpłytkowego i osocza zubożonego w mikrocząstki) bez dodatku aktywatora krzepnięcia. Po krzepnięciu próbek osocza indukowanym przez Ca2+ monitoruje się gęstość optyczną przy λ = 405 nm w temperaturze 37°C.

II. Test wytwarzania trombiny. Ilość trombiny utworzonej w osoczu po ponownym zwapnieniu jest mierzona bezpośrednio przy użyciu zmodyfikowanego testu wytwarzania trombiny. Ponieważ fibryna zakłóca pomiary kolorymetryczne, próbki osocza są najpierw rozwłókniane przez dodanie reptilazy, a następnie inkubowane w temperaturze 37°C. Skrzepy są usuwane. Następnie do próbek osocza dodaje się chromogenny substrat dla trombiny. Wytwarzanie trombiny rozpoczyna się przez dodanie CaCl2 z jednoczesnym rejestrowaniem absorbancji przy λ = 405 nm.

iii. Zdolność generowania trombiny przez posłów. MP są rekonstytuowane w odwłóknionym (traktowanym reptilazą), normalnym połączonym osoczu pozbawionym mikrocząstek. Następnie do próbek dodaje się chromogenny substrat dla trombiny. Wytwarzanie trombiny rozpoczyna się przez dodanie CaCl2 z jednoczesnym rejestrowaniem absorbancji przy λ = 405 nm.

iv. Eksperymenty z hamowaniem wytwarzania trombiny. Następujące inhibitory są wstępnie inkubowane z mikrocząstkami: aneksyna V, anty-ludzki czynnik tkankowy (TF) i nieistotna kontrolna immunoglobulina G (IgG). Następnie powtarza doświadczenie iii.

v. Aktywność fibrynolityczna. Inkubować plazminogen w ustalonym stężeniu z próbkami osocza w obecności chromogennego substratu selektywnego względem plazminy. Plazmina utworzona z plazminogenu związanego na powierzchni mikrocząstek rozszczepia substrat chromogenny i uwalniana p-nitroanilina jest wykrywana przez pomiar A405nm w funkcji czasu.

wi. Oznaczanie aktywności fibrynolitycznej mikrocząstek. Zdolność mikrocząstek do aktywacji plazminogenu określa się przez inkubację plazminogenu w ustalonym stężeniu (1 mM) z mikrocząstkami z lub bez t-PA i/lub u-PA w obecności chromogennego substratu selektywnego względem plazminy. Plazmina utworzona z plazminogenu związanego na powierzchni mikrocząstek rozszczepia chromogenny substrat i wykrywa się uwolnioną p-nitroanilinę mierząc A405nm.

VII. Eksperymenty z hamowaniem aktywności fibrynolitycznej. Następujące inhibitory są wstępnie inkubowane z mikrocząstkami: aktywator plazminogenu typu tkanki ludzkiej (tPA), aktywator plazminogenu typu urokinazy człowieka (uPA) i odpowiednie nieistotne kontrolne IgG; Kwas ε-aminokapronowy i inhibitor aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1). Następnie powtórz doświadczenie vi.