Papel das Micropartículas na Coagulopatia da Leucemia Promielocítica Aguda

Os investigadores planejam medir parâmetros laboratoriais de rotina de coagulação e fibrinólise, a atividade pró-coagulante ou profibrinolítica de micropartículas (MPs) e explorar o papel do fator ativador pró-coagulante e profibrinolítico de MPs na patogênese da coagulopatia em pacientes com APL.

eu. Turbidimetria dinâmica da formação de coágulos plasmáticos. Os efeitos das MPs na cinética de formação de fibrina e nas propriedades ópticas de coágulos são estudados usando turbidimetria dinâmica de amostras de plasma recalcificado (plasma sem plaquetas e plasma depletado de micropartículas) sem adição de qualquer ativador de coagulação. A coagulação de amostras de plasma induzida por Ca2+ é seguida pelo monitoramento da densidade óptica em λ = 405 nm a 37 °C.

ii. Ensaio de geração de trombina. A quantidade de trombina formada no plasma após a recalcificação é medida diretamente usando um teste modificado de geração de trombina. Como a fibrina interfere nas medições colorimétricas, as amostras de plasma são primeiro desfibrinadas pela adição de reptilase, seguida de incubação a 37 °C. Os coágulos são removidos. Em seguida, um substrato cromogênico para trombina é adicionado às amostras de plasma. A geração de trombina é iniciada pela adição de CaCl2 com registro simultâneo da absorbância em λ = 405 nm.

iii. Capacidade de geração de trombina das MPs. As MPs são reconstituídas em plasma desfibrinado (tratado com reptilase) normal reunido com depleção de micropartículas. Em seguida, um substrato cromogênico para trombina é adicionado às amostras. A geração de trombina é iniciada pela adição de CaCl2 com registro simultâneo da absorbância em λ = 405 nm.

4. Experiências inibitórias da geração de trombina. Os seguintes inibidores são pré-incubados com as micropartículas: Anexina V, fator anti-tecido humano (TF) e imunoglobulina G (IgG) de controle irrelevante. Em seguida, repete o experimento iii.

v. Atividade fibrinolítica. Incubar uma concentração fixa de plasminogênio com as amostras de plasma na presença de um substrato cromogênico seletivo para plasmina. A plasmina formada a partir do plasminogênio ligado à superfície das micropartículas cliva o substrato cromogênico e a p-nitroanilina liberada é detectada medindo A405nm em função do tempo.

vi. Determinação da atividade fibrinolítica em micropartículas. A capacidade das micropartículas para ativar o plasminogênio é determinada pela incubação de uma concentração fixa de plasminogênio (1 mM) com as micropartículas com ou sem t-PA e/ou u-PA na presença de um substrato cromogênico seletivo para plasmina. A plasmina formada a partir do plasminogênio ligado à superfície das micropartículas cliva o substrato cromogênico e a p-nitroanilina liberada é detectada medindo A405nm.

vii. Experimentos inibidores da atividade fibrinolítica. Os seguintes inibidores são pré-incubados com as micropartículas: anti-ativador do plasminogênio tipo tecido humano (tPA), anti-ativador do plasminogênio tipo uroquinase humana (uPA) e respectivos IgGs de controle irrelevantes; ácido ε-aminocapróico e inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Em seguida, repita o experimento vi.