Ruolo delle microparticelle nella coagulopatia della leucemia promielocitica acuta

I ricercatori intendono misurare i parametri di laboratorio di routine della coagulazione e della fibrinolisi, l'attività procoagulante o profibrinolitica delle microparticelle (MP) ed esplorare il ruolo del fattore di attivazione procoagulante e profibrinolitico delle MP nella patogenesi della coagulopatia nei pazienti con APL.

io. Turbidimetria dinamica della formazione di coaguli plasmatici. Gli effetti delle MP sulla cinetica di formazione della fibrina e sulle proprietà ottiche dei coaguli sono studiati mediante turbidimetria dinamica di campioni di plasma ricalcificato (plasma privo di piastrine e plasma impoverito di microparticelle) senza l'aggiunta di alcun attivatore della coagulazione. La coagulazione dei campioni di plasma indotta da Ca2+ è seguita dal monitoraggio della densità ottica a λ = 405 nm a 37 °C.

ii. Saggio di generazione della trombina. La quantità di trombina formata nel plasma dopo la ricalcificazione viene misurata direttamente utilizzando un test di generazione di trombina modificato. Poiché la fibrina interferisce con le misurazioni colorimetriche, i campioni di plasma vengono prima defibrinati mediante l'aggiunta di reptilasi seguita da incubazione a 37 °C. I coaguli vengono rimossi. Quindi ai campioni di plasma viene aggiunto un substrato cromogenico per la trombina. La generazione di trombina viene avviata aggiungendo CaCl2 con registrazione simultanea dell'assorbanza a λ = 405 nm.

iii. Capacità di generazione di trombina dei parlamentari. Le MP vengono ricostituite in plasma defibrinato (trattato con reptilasi), normale impoverito di microparticelle. Quindi ai campioni viene aggiunto un substrato cromogenico per la trombina. La generazione di trombina viene avviata aggiungendo CaCl2 con registrazione simultanea dell'assorbanza a λ = 405 nm.

iv. Esperimenti di inibizione della generazione di trombina. I seguenti inibitori sono pre-incubati con le microparticelle: annessina V, fattore tissutale antiumano (TF) e immunoglobulina G (IgG) di controllo irrilevante. Poi ripete l'esperimento iii.

v. Attività fibrinolitica. Incubare una concentrazione fissa di plasminogeno con i campioni di plasma in presenza di un substrato cromogenico selettivo per la plasmina. La plasmina formata dal plasminogeno legato alla superficie delle microparticelle scinde il substrato cromogenico e la p-nitroanilina rilasciata viene rilevata misurando A405nm in funzione del tempo.

VI. Determinazione dell'attività fibrinolitica su microparticelle. La capacità delle microparticelle di attivare il plasminogeno viene determinata incubando una concentrazione fissa di plasminogeno (1 mM) con le microparticelle con o senza t-PA e/o u-PA in presenza di un substrato cromogenico selettivo per la plasmina. La plasmina formata dal plasminogeno legato alla superficie delle microparticelle scinde il substrato cromogenico e la p-nitroanilina rilasciata viene rilevata misurando A405nm.

vii. Esperimenti di inibizione dell'attività fibrinolitica. I seguenti inibitori sono pre-incubati con le microparticelle: anti-attivatore del plasminogeno di tipo tissutale umano (tPA), anti-attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi umano (uPA) e le rispettive IgG di controllo irrilevanti; Acido ε-amminocaproico e inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1). Quindi ripetere l'esperimento vi.