Krążące DNA guza (ctDNA) jako narzędzie prognostyczne u pacjentów z zaawansowanym gruczolakorakiem płuc

Chociaż EGFR- i ALK-TKI mogą osiągnąć odsetek odpowiedzi nawet do 70%, wszyscy pacjenci leczeni TKI niezmiennie rozwijają oporność na terapię. Mediana przeżycia wolnego od progresji wynosi 10-16 miesięcy. Najczęstszym mechanizmem nabytej oporności na TKI jest indukowana terapią selekcja klonalna niewielkiej subpopulacji opornych komórek nowotworowych, które były obecne w pierwotnym guzie. Pojawienie się mutacji EGFR T790M występuje u około 50-70% pacjentów z nabytą opornością na EGFR-TKI. Inne mutacje EGFR i mutacje w katalitycznej podjednostce alfa kinazy 3-fosfatydyloinozytolu-4,5-bisfosforanu (PIK3CA) i protoonkogenie B-Raf (BRAF) są również związane z opornością na EGFR-TKI, ale występują z niską częstotliwością. Oporność na ALK-TKI jest bardziej złożona i obejmuje różne mutacje oporności.

Oporność na TKI pozostaje głównym problemem w leczeniu klinicznym NSCLC. Pacjenci z nabytą opornością mogą być leczeni za pomocą TKI drugiej generacji, chociaż żaden z nich nie został jeszcze zatwierdzony przez FDA, ani za pomocą strategii terapii skojarzonej. Dlatego charakterystyka molekularna guza w przebiegu choroby jest pomocna w dopasowywaniu nowych leków do ewoluującego profilu genomowego guza i prowadzeniu skutecznych spersonalizowanych terapii. Jednak seryjne pobieranie próbek tkanek w celu monitorowania sygnatur molekularnych guza jest inwazyjne, niepraktyczne i nie jest rutynową praktyką kliniczną. Uzyskanie wystarczającej ilości materiału tkankowego do genotypowania jest również główną przeszkodą w pobieraniu próbek tkanek. Istnieje potrzeba opracowania technologii umożliwiającej nieinwazyjną seryjną analizę profili genomowych nowotworów.

Krążący DNA wolny od komórek to pofragmentowany DNA znajdujący się w krążeniu, który nie jest związany z komórkami lub fragmentami komórek. Kiedy komórki nowotworowe umierają, uwalniają DNA nowotworu do krwioobiegu. Bezkomórkowy krążący DNA pochodzący z guzów, znany jako krążący DNA nowotworu (ctDNA), przenosi mutacje obecne w guzie, a zatem można go odróżnić od bezkomórkowego krążącego DNA pochodzącego z normalnych komórek. Wykazano, że wykrycie ctDNA i jego stężenia koreluje ze stopniem zaawansowania nowotworu i przeżyciem nowotworu. Co więcej, ctDNA w osoczu można wykorzystać do wykrywania zmian genomowych w nowotworach litych oraz że istnieje wysoka zgodność wykrytych mutacji między sparowanymi próbkami DNA utrwalonymi w formalinie i zatopionymi w parafinie (FFPE) a próbkami DNA osocza.

W badaniu nabytej oporności na blokadę EGFR u chorych na raka jelita grubego pobierano powtarzane próbki surowicy w odstępach 4-tygodniowych, aż do progresji choroby. Korzystając z modelowania matematycznego, badanie to przyniosło następujące ważne wnioski: oporne mutacje były obecne w subpopulacji klonalnej w obrębie guzów przed rozpoczęciem leczenia, ekspansja subklonu zajęła dość stały okres czasu (około 5-6 miesięcy) i ponownie zaludnić zmianę, a krążące oporne mutacje można było wykryć kilka miesięcy przed radiograficznymi dowodami progresji choroby. To przełomowe badanie wykazało potencjał wykorzystania testu ctDNA do śledzenia ewolucji genomu i selekcji w nowotworach w sposób nieinwazyjny w celu ułatwienia zindywidualizowanych terapii, a tym samym przedłużenia remisji.

Badacze wykazali wykrywanie mutacji EGFR w osoczu u pacjentów z zaawansowanym gruczolakorakiem płuc z mutacjami EGFR, co koreluje z rokowaniem pacjentów otrzymujących EGFR-TKI. W jednym prospektywnym badaniu wykorzystano reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w celu wykrycia mutacji EGFR w ctDNA pacjentów z zaawansowanym NSCLC. Wśród pacjentów z mutacją EGFR + na początku badania (przed leczeniem), ci, którzy utracili mutację EGFR w 3. cyklu leczenia (chemioterapia +/- erlotynib) mieli lepsze przeżycie wolne od progresji choroby; mediana przeżycia wynosiła 7,2 vs. 12,0 miesięcy u pacjentów z mutacją EGFR (+,+) i (+,-) odpowiednio na początku badania iw 3. cyklu.

Inne badania wykazały również wykonalność innych mutacji onkogennych, zwłaszcza mutacji KRAS.

Chociaż badania te wykazały wykonalność wykrywania mutacji nowotworowych w ctDNA, ograniczały się one do badania pojedynczego genu (np. EGFR lub KRAS).

W innych badaniach stosowano sekwencjonowanie nowej generacji u pacjentów z NSCLC. Laboratorium Maxa Diehna na Uniwersytecie Stanforda opracowało metodę ilościowego określania ctDNA poprzez głębokie sekwencjonowanie >130 genów. U 17 pacjentów ze sparowanymi próbkami DNA osocza i tkanek nowotworowych byli w stanie wykryć wszystkie mutacje zidentyfikowane wcześniej w tkance oraz wiele dodatkowych wariantów somatycznych. Odkryli również, że poziomy ctDNA są silnie skorelowane z objętością guza. Ich badanie dotyczyło wielu genów, ale nie zawierało prospektywnego komponentu do śledzenia mutacji ctDNA i korelacji określonych mutacji z wynikiem leczenia.

Nigdy nie przeprowadzono badań ctDNA u pacjentów otrzymujących chemioterapię. Profilowanie genomowe może zidentyfikować mutacje związane z opornością i odpowiedzią na chemioterapię.

W związku z tym badacze proponują badanie podłużne u pacjentów z zaawansowanym NSCLC leczonych TKI pierwszego rzutu lub chemioterapią w celu prospektywnego pobrania seryjnych próbek krwi i przy użyciu sekwencjonowania ctDNA nowej generacji w celu zbadania ewolucyjnych profili genomowych. Niniejsze badanie ma na celu ocenę użyteczności testu ctDNA w identyfikacji markerów genomowych do przewidywania odpowiedzi na leczenie i przeżycia u pacjentów z zaawansowanym NSCLC.

To proponowane badanie zbada użyteczność ctDNA w identyfikacji markerów genomowych do prognozowania NSCLC u pacjentów leczonych pierwszą linią TKI lub chemioterapią. Po postawieniu diagnozy pacjenci będą obserwowani w odstępach 3-miesięcznych. Podczas każdej wizyty badawczej pobierane będą próbki osocza oraz, gdy jest to klinicznie wskazane, pobierane będą również próbki tkanek. Profilowanie genomowe nowotworów zostanie przeprowadzone w próbce tkanki FFPE oraz w ctDNA wyekstrahowanym z prospektywnie pobranych próbek osocza. Cele to:

1. Określenie zgodności i niezgodności mutacji somatycznych stwierdzonych w ctDNA i DNA tkanki nowotworowej.
2. Aby zidentyfikować mutacje w ctDNA, które są związane z rokowaniem (odpowiedź na leczenie i przeżycie wolne od progresji) u pacjentów otrzymujących (a) leczenie EGFR-TKI, (b) leczenie ALK-TKI lub (c) chemioterapię.
3. Śledzenie molekularnego przebiegu w czasie pod względem (a) zmiany całkowitego stężenia ctDNA w czasie, (b) kiedy mutacje związane z opornością/nawrotem są po raz pierwszy wykrywalne w osoczu oraz (c) w jaki sposób frakcje mutacji komórek związanych z opornością mutacje zmieniają się w czasie.
4. Połączenie informacji z Celów 2 i 3 w celu opracowania modeli prognostycznych do prognozowania u pacjentów otrzymujących (a) leczenie EGFR-TKI, (b) leczenie ALK-TKI lub (c) chemioterapię.