Mikrobiota u pacjentów z COVID-19 dla przyszłych metod terapeutycznych i zapobiegawczych (MICRO-COV)

W grudniu 2019 r. zgłoszono ciężkie przypadki zapalenia płuc w związku z hurtowym rynkiem owoców morza Huanan w Wuhan w Chinach. Cztery miesiące i ponad tysiąc zgonów później, patogen odpowiedzialny za największą i najbardziej krytyczną sytuację zdrowotną na świecie w ciągu ostatnich 100 lat, znany jest jako koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19) jest scharakteryzowana jako choroba przenoszona z długim okresem inkubacji wynoszącym od 7 do 14 dni. W około 10% przypadków obserwuje się ciężki przebieg choroby. Chociaż opisano czynniki predysponujące, takie jak starszy wiek, przewlekłe nadciśnienie tętnicze, cukrzyca, a także inne choroby współistniejące, niewiele wiadomo na temat mechanizmu patofizjologicznego, który wywołuje ostrą niewydolność płuc, w połączeniu z często pojawiającym się patognomonicznym uszkodzeniem serca, nerek i naczyń za śmiertelny przebieg tej choroby.

Wysiękowe i śródmiąższowe zapalenie pęcherzyków płucnych upośledzające wymianę gazową pęcherzykowo-włośniczkową opisane w odniesieniu do SARS-CoV-2 spełnia definicję zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Mechanika patofizjologiczna stojąca za tym uszkodzeniem płuc została najlepiej opisana w ARDS wywołanym przez posocznicę bakteryjną i jest indukowana głównie przez wynaczynienie granulocytów obojętnochłonnych z naczyń włosowatych do płuc. Jednym z głównych mediatorów wynaczynienia neutrofili jest degeneracja powierzchniowej warstwy śródbłonka, czyli glikokaliksu, wywołana przez siarczan heparanu aktywowany endotoksynami. Przerzedzenie i destrukcja glikokaliksu ujawnia ukryte cząsteczki adhezyjne na powierzchni śródbłonka, takie jak VCAM-1 i ICAM-1. W ten sposób zwiększona adhezja neutrofili w połączeniu z zapalnym przemieszczaniem kadheryny VE do wnętrza komórek śródbłonka, w którym pośredniczą cytokiny zapalne, rozluźnienie ścisłych połączeń śródbłonka, pozwala na zwiększone wynaczynienie neutrofili i dyfuzję płynu bogatego w białko do śródmiąższu . Stworzone w ten sposób środowisko indukuje aktywację i degranulację granulocytów obojętnochłonnych oraz uwalnianie toksycznych mediatorów, które niszczą nabłonek pęcherzyków płucnych i wytwarzają dalsze immunocytokiny, indukują burzę cytokinową i zwiększają rekrutację neutrofili. Wreszcie agregacja inaktywowanego płucnego środka powierzchniowo czynnego przez bogaty w białko obrzęk połączony ze zdegenerowanymi komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 1 i pokrytą błoną szklistą, pozbawioną nagiej błony podstawnej pęcherzyków płucnych, zaburza zdolność wymiany gazowej błony pęcherzykowo-włośniczkowej, upośledzając krew utlenianie i dekarboksylacja.

W przeciwieństwie do ARDS wywoływanego przez bakterie, czynniki wirusowe powodujące ARDS docierają głównie do nabłonka pęcherzyków płucnych poprzez transport wirusa z nosogardzieli, z górnych do dolnych dróg oddechowych. W infekcjach wirusowych uszkodzenie płuc jest spowodowane głównie bezpośrednią inwazją wirusową pneumocytów typu 1 i 2. Powoduje to kumulację obrzęku białkowego w dwojaki sposób poprzez wyłączenie kanałów ENaC, odpowiedzialnych głównie za udrażnianie komory pęcherzykowej poprzez tworzenie gradientu osmotycznego oraz poprzez naruszenie bariery fizyko-chemicznej utworzonej przez pneumocyty. Chociaż efekt przerwania bariery pęcherzykowej poprzez dysfunkcję śródbłonka naczyniowego jest zmniejszony w przeciwieństwie do posocznicy bakteryjnej, wraz z postępem ARDS, zarówno śródbłonek, jak i nabłonek wydzielają chemotaktory przyciągające makrofagi i neutrofile do objętego stanem zapalnym płuca, co analogicznie do bakteryjnego ARDS indukuje wtórne uszkodzenie płuc, jak już opisano. Jednak wskazują na przesadny początkowy przeciek włośniczkowy w porównaniu z innymi postaciami ARDS, co silnie sugeruje dysfunkcję śródbłonka jako główny mechanizm.

Uszkodzenie komórek śródbłonka można ocenić zarówno przy użyciu produktów degradacji glikokaliksu, takich jak syndekan-1, siarczan heparanu i VE-kadheryny, jak i bezpośredniej wizualizacji właściwości przepływu krwinek czerwonych w naczyniach włosowatych za pomocą ręcznej mikroskopii przyżyciowej (HVM) wykorzystującej technikę mikroskopii ciemnego pola. Niedawne postępy w grupie badaczy umożliwiły dokładne różnicowanie trybów niewydolności mikrokrążenia poprzez ilościowe określenie zdolności dyfuzyjnej i konwekcyjnej mikrokrążenia. Z perspektywy globalnej przeciek pęcherzykowy został wcześniej określony ilościowo za pomocą termodylucji przezpłucnej. Narzędzia te zapewniają optymalne warunki wstępne do specyficznego wykrywania (produkty degradacji glikokaliksu w płynie z płukania pęcherzyków płucnych) i określania ilościowego (termodylucja przezpłucna) uszkodzenia komórek śródbłonka w płucach podczas ARDS spowodowanego zakażeniem SARS-CoV-2. Co więcej, we wstępnych raportach opisano, że u około 20% krytycznie chorych pacjentów cierpiących na ARDS z powodu zakażenia SARS-CoV-2 rozwinęła się ciężka ogólnoustrojowa odpowiedź zapalna i wstrząs krążeniowy. U tych pacjentów związek między uszkodzeniem komórek śródbłonka pęcherzyków płucnych a ogólnoustrojowym uszkodzeniem komórek śródbłonka ma kluczowe znaczenie i można go ocenić za pomocą jednoczesnego pomiaru HVM podjęzykowo.

Po wirusowym i zapalnym uszkodzeniu płuc jako początkowym wyzwalaczu ARDS, dalsze pogorszenie czynności płuc może zależeć głównie od nadkażenia. Nadkażenie bakteryjne i grzybicze zostało opisane jako odpowiedzialne głównie za zachorowalność i śmiertelność wirusowego ARDS w środkowej i późnej fazie podczas podobnych pandemii, takich jak grypa hiszpanka w 1918 r. W obecnej epidemii w Chinach obecność nadkażeń bakteryjnych i grzybiczych stwierdzono u 10 do 30%. Wydaje się, że nadkażenie stanowi główny czynnik ryzyka śmiertelności u pacjentów z COVID-19. Chociaż nie jest jasne, czy wykrycie nadkażenia bakteryjnego i grzybiczego ma znaczenie kliniczne i terapeutyczne, kilku autorów opowiada się za empiryczną antybiotykoterapią ukierunkowaną głównie na S. aureus i S. pneumonia.

Nie tylko stratyfikacja ryzyka związanego z nadkażeniami bakteryjnymi i grzybiczymi ma znaczenie dla oceny ciężkości progresji choroby, ale należy jeszcze ocenić, w jakim stopniu obecność szpitalnego przenoszenia patogenów podczas pandemii istnieje i jest odpowiedzialna za zachorowalność i śmiertelność w hospitalizowani pacjenci. Środki zapobiegania zakażeniom, takie jak standardowe i izolacyjne środki ostrożności, mają na celu zapobieganie szpitalnemu przenoszeniu patogenów w placówkach opieki zdrowotnej. Środki te obejmują higienę rąk, stosowanie środków ochrony indywidualnej (PPE) (np. fartuchy izolacyjne, rękawiczki, maski, maski oddechowe, środki ochrony oczu) oraz środki ochrony środowiska – takie jak czyszczenie i dezynfekcja powierzchni oraz sprzętu i instrumentów medycznych. Jednak urządzenia mobilne, takie jak prywatne i profesjonalne telefony komórkowe, w dużej mierze nie zostały uwzględnione w takich wytycznych. Urządzenia te mogą odgrywać ważną rolę w pośredniej transmisji kontaktowej. Oznacza to, że zanieczyszczony przedmiot pośredni bierze udział w przenoszeniu zakaźnego patogenu między dwoma osobnikami.

Obecne dowody, choć ograniczone, wykazały zwiększoną żywotność SARS-CoV-2 na plastiku i stali nierdzewnej, materiałach często stosowanych w urządzeniach mobilnych i osłonach ochronnych, do 72 godzin. Chociaż niewłaściwa higiena rąk, brak środków ochrony osobistej i inne rutynowe błędy higieniczne są najbardziej oczywistymi wektorami patogenów szpitalnych, stwierdzono, że telefony komórkowe i inne urządzenia podręczne są niewystarczająco dezynfekowane, co umożliwia kolonizację patogenów, z których S. aureus jest najbardziej częsty. Sytuację pogarsza fakt, że pracownicy służby zdrowia dotykali przedmiotów ruchomych, w tym telefonów komórkowych, średnio raz na 6,9 sekundy i dotykali własnego ciała lub twarzy co 40 sekund. Towarzyszyło temu wyjątkowo niskie przestrzeganie protokołów higieny rąk przed kolonizacją i infekcjami. Odkrycia te podkreślają potencjał urządzeń mobilnych jako wektorów przenoszenia patogenów zarówno na pacjentów, jak i pracowników służby zdrowia.

W zwalczaniu infekcji wirusowych wrodzona obrona immunologiczna rozpoznaje infekcję wirusową głównie poprzez wiązanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) z receptorami rozpoznawania patogenów (PRR). Kaskada ekspresji indukowana przez te wiązania receptorów stymuluje szlak interferonu (IFN) typu I i III. Rekrutacja zapalnej osi monocyt-makrofag-neutrofil przez szlak IFN I jest niezbędna w walce z większością infekcji wirusowych. Niemniej jednak wirusy, takie jak wirus grypy A, są w stanie uniknąć inicjacji IFN typu I i III, przenosząc swoją maszynerię replikacji do jądra komórkowego, unikając w ten sposób PRR zlokalizowanych w cytoplazmie lub inaktywując mRNA interferonu przez białka. Szlak IFN I może działać dwojako w tych wirusach; z jednej strony może pośredniczyć w początkowym działaniu przeciwko wirusowi, zmniejszając maksymalne osiągnięte miana, z drugiej strony, w pewnych okolicznościach może mimo wszystko patologicznie nadekspresować, indukując burzę cytokinową i zwiększając uszkodzenie miąższu płuc.

SARS-CoV i SARS-CoV-2 to wirusy RNA o dodatniej polaryzacji, które penetrują ścianę komórkową zakażonych komórek na drodze endocytozy, w której pośredniczy receptor ACE-2. Początek ekspresji szlaku IFN I może wiązać się z silniejszą aktywacją szlaku IFN II i indukcją prozapalnej burzy cytokin, a w konsekwencji poważniejszą dysregulacją zapalnego układu monocyt-makrofag i stopniem immunopatologicznego uszkodzenia płuc. Mechanika patofizjologiczna tego nowego ARDS wywołanego przez SARS-CoV-2 i wywoływane przez niego rozregulowanie ogólnoustrojowe można jedynie spekulować na podstawie jego poprzednika SARS-CoV, a spostrzeżenia wyjaśniające niezwykły obraz kliniczny nowej choroby są rozpaczliwie potrzebne do uzyskania optymalnego leczenia zbliżać się.

Podsumowując, mechanizmy ciężkości choroby w krytycznie chorych SARS-CoV-2 ARDS są wielorakie, począwszy od rozregulowanej odpowiedzi zapalnej, przez obecność nadkażeń bakteryjnych i grzybiczych, aż po znaczenie transmisji szpitalnej jako kluczowego elementu, na który można celować z dnia na dzień - dzienna opieka nad pacjentem. Tylko globalna ocena wszystkich aspektów potencjalnie odpowiedzialnych za nasilenie postępu choroby u pacjentów z COVID-19 może mieć na celu wyjaśnienie leżącej u podstaw mikstury.

Cele projektu Nadrzędnym celem tych badań jest zdobycie wiedzy patofizjologicznej w celu poprawy zachorowalności i śmiertelności w ARDS spowodowanym zakażeniem SARS-CoV-2. Badania te koncentrują się zatem na stanach zapalnych, dysfunkcjach mikrokrążenia i nadkażeniach, mając na celu wyjaśnienie czynników ryzyka rozwoju ciężkiego ARDS u pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 i przyczynienie się do uzasadnienia strategii terapeutycznych.

Indywidualne hipotezy robocze to:

1. Uważa się, że w pierwotnym uszkodzeniu płuc w SARS-CoV-2 ARDS pośredniczy przesadna odpowiedź prozapalna powodująca pierwotną dysfunkcję śródbłonka, a następnie działająca podwójnie na degradację miąższu płuc, poprzez pierwotną odpowiedź cytokinową, oraz poprzez rekrutację osi stan zapalny-monocyty-limfocyty-neutrofile. Wyraźny stan zapalny i pierwotne uszkodzenie płuc zaburzają mikrobiom płucny, prowadząc wtórnie do nadkażeń płucnych.
2. Nadkażenia bakteryjne płuc (tj. S. pneumoniae, S. aureus, P. aeruginosa i inne) są istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z COVID-19. Kolonizacja patogenów w górnych drogach oddechowych jest przesłanką i głównym czynnikiem ryzyka infekcji dolnych dróg oddechowych. Aby ustanowić kolonizację, patogeny muszą wchodzić w interakcje z lokalną mikroflorą (tzw. mikrobiomu), a niektóre profile mikrobiomu będą bardziej odporne na inwazję patogenów.
3. Urządzenia podręczne stosowane w praktyce klinicznej są nosicielami zarówno SARS-CoV-2, jak i bakterii wywołujących szpitalne zapalenie płuc, co czyni je potencjalnym rezerwuarem pośredniej transmisji kontaktowej. Ukierunkowana interwencja zapobiegająca zakażeniom może zmniejszyć to zanieczyszczenie, a tym samym zmniejszyć ryzyko przenoszenia szpitalnego.