Badanie identyfikacji wczesnej sepsy molekularnej (MESIS)

Wprowadzenie Sepsa została ostatnio ponownie zdefiniowana (Sepsis 3) jako infekcja prowadząca do dysfunkcji narządu (1). Chociaż definicja ta nie jest ogólnie akceptowana przez wszystkich badaczy (2,3) ze względu na możliwość opóźnionego rozpoznania, śmiertelność związana z tą jednostką chorobową mogłaby zostać znacznie zmniejszona poprzez wczesne przyjęcie protokołów diagnostycznych oraz odpowiednie i wczesne zastosowanie terapii przeciwdrobnoustrojowej (ATB).

Niedawne badanie przeprowadzone w Katalonii (4) wykazało częstość występowania 212 przypadków sepsy na 100 000 mieszkańców rocznie, przy śmiertelności szpitalnej na poziomie 21%, co jest wartością znacznie wyższą, jeśli weźmiemy pod uwagę pacjentów na OIT (40%) lub pacjentów dotkniętych wstrząsem septycznym (> 50%) (5,6). Dane te podkreślają obecne znaczenie tej jednostki i wskazują na potrzebę poszukiwania nowych alternatyw dla wczesnej i właściwej diagnostyki oraz leczenia, które korzystnie wpłynęłoby na wysoką śmiertelność.

Nieskuteczne leczenie sepsy jest często spowodowane późnym rozpoznaniem sepsy, ze względu na nieodłączne powikłanie niespecyficznych objawów klinicznych. Chociaż wydaje się, że prokalcytonina (PCT) jest odpowiednim biomarkerem do diagnozowania infekcji bakteryjnych (7,8), różne badania wykazują dyskryminację tylko na poziomie około 80% (7,8), a najnowsze międzynarodowe wytyczne nie zalecają jej stosowania (9, 10,11). Te same wytyczne zalecają stosowanie skal, takich jak SOFA (sekwencyjna ocena niewydolności narządów) i qSOFA (wersja uproszczona) na podstawie obecności zaburzeń świadomości, niedociśnienia i tachypnoe) do wczesnej stratyfikacji ryzyka u pacjentów z podejrzeniem zakażenia.

Jednak sepsa i nieseptyczne ogólnoustrojowe zespoły zapalne są klinicznie podobnymi jednostkami chorobowymi i często są komplikowane pojawieniem się dysfunkcji narządów. Dlatego identyfikacja sepsy pozostaje subiektywna i może prowadzić do nadrozpoznawalności sepsy, aw konsekwencji do częstego stosowania ATB u pacjentów, którzy nie mają sepsy i którzy nie odnoszą korzyści z tego leczenia (12).

Dostępność nowych technik molekularnych i automatyzacja tych analiz laboratoryjnych pobudziły poszukiwanie biomarkerów związanych z odpowiedzią gospodarza na posocznicę. Analiza ekspresji genów gospodarza za pomocą transkryptów RNA (transkryptomika) stwarza możliwości w tej złożonej sytuacji krytycznie chorego pacjenta. Ekspresja genów gospodarza różni się znacznie między pacjentami z sepsą a osobami zdrowymi (13). Jednakże, chociaż ekspresja genów między pacjentami z zapaleniem septycznym i nieseptycznym w dużym stopniu pokrywa się, kilka różnic między transkryptami obserwowanymi w sepsie może pomóc odróżnić infekcję od innych przyczyn zapalenia [14]. Test transkrypcyjny SeptiCyte™ LAB został opracowany w celu diagnozowania infekcji u krytycznie chorych pacjentów z podejrzeniem sepsy [15]. Jest to pierwszy test odpowiedzi gospodarza oparty na ilościowej metodzie PCR z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR), który został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA). SeptiCyte™ LAB umożliwia ocenę odpowiedzi gospodarza na infekcję poprzez pomiar ekspresji określonych genów zaangażowanych w funkcje odpornościowe i sygnalizację stanu zapalnego w pełnej krwi. Test polega na jednoczesnej amplifikacji 4 transkryptów RNA

1. cząsteczka adhezyjna komórek związana z antygenem rakowo-płodowym 4 (CEACAM4),
2. białko błonowe związane z liposomami 1 (LAMP1),
3. specyficzne dla łożyska białko adhezyjne 8 (PLAC8) i
4. fosfolipaza A2 grupa VII (PLA2G7)

W pierwszym badaniu skuteczności klinicznej SeptiCyte™ LAB przeanalizowano 345 pacjentów włączonych do kohorty MARS (Molecular Diagnosis and Sepsis Risk Stratification) na dwóch oddziałach intensywnej terapii w Holandii [15]. Pacjenci zostali sklasyfikowani jako chorzy na sepsę na podstawie medycznej oceny post-hoc dostępnych dowodów klinicznych, radiologicznych i mikrobiologicznych [16], w wyniku czego oszacowano AUC (0,77 do 0,99), czułość (79% do 100%) i swoistość ( 33% do 91%) różniły się znacznie w zależności od częstości występowania sepsy, poziomu ufności w odniesieniu do rozpoznania referencyjnego oraz tego, czy rejestracja pacjenta była następna. W podgrupie post-hoc 157 pacjentów z pełnymi danymi, SeptiCyte™ LAB (AUC 0,88, 95% CI 0,81-0,93) przewyższał dyskryminację PCT (AUC 0,84, 95% CI 0,76-0,92, p<0,001). Jednak najlepszą zdolność dyskryminacyjną osiągnięto przez połączenie obu biomarkerów (AUC 0,89, 95% CI 0,82-0,95, p<0,01). Ponieważ analiza ta zajęła około 6 godzin, opracowano narzędzie do diagnostyki wczesnej sepsy (SeptiCyte RAPID (17)), które opiera się na pomiarze dwóch z czterech biomarkerów ekspresji genów we krwi obwodowej (PLAC8 i PLA2G7) przy użyciu tej samej ilościowej metody odwrotnej transkrypcyjnej reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-qPCR) i ściśle koreluje z wynikami klinicznymi SeptiCyte LAB, ale ze znacznie prostszym przebiegiem pracy. Na podstawie wyników urządzenie generuje raport ze skalą prawdopodobieństwa wystąpienia sepsy. (patrz załączony algorytm) Ta nowa metodologia analizy, wraz ze zwykłymi biomarkerami, może poprawić wczesną diagnostykę sepsy, rozróżnić pacjentów z zapaleniem i sepsą.

Test identyfikacji posiewu krwi FilmArray® (BCID®) jest testem molekularnym zatwierdzonym do bezpośredniej identyfikacji patogenów powodujących BSI z pozytywnego BC (18). Niedawno zaktualizowana wersja panelu (BCID2®) zawiera ulepszone właściwości identyfikacji gatunków i pozwala na wykrycie jednego genu β-laktamazy o rozszerzonym spektrum (ESBL) i kilku genów kodujących karbapenemazy. Panel BCID2® testuje 43 cele związane z infekcjami krwi, w tym bakterie Gram-ujemne, bakterie Gram-dodatnie, drożdże i 10 genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe - wszystkie za pomocą jednego testu i z wynikami dostępnymi po około godzinie od dodatniego posiewu krwi. Ponadto menu panelu BCID2® zawiera siedem dodatkowych genów oporności, w tym karbapenemazy, geny oporności na kolistynę, a test MREJ pozwala na dokładniejszą identyfikację MRSA. Niedawne badanie (19) ocenia skuteczność kliniczną testu BCID2 do identyfikacji gatunków w 180 dodatnich posiewach krwi (BC). Wyniki BCID2 były zgodne ze standardem opieki (SOC) w 159/180 (88,3%) pne; Zgodnie z wynikami SOC zidentyfikowano 68/74 (91,9%) i 71/74 (96,0%) wszystkich próbek, w których hodowano odpowiednio patogeny monobakteryjne, Gram-dodatnie lub Gram-ujemne. Niezgodność była związana z wykryciem dodatkowych patogenów w teście BCID2 (n = 4), rozbieżną identyfikacją gatunku (n = 4) lub niepowodzeniem BCID2 w wykrywaniu patogenów na panelu (n = 1).

Zwykła implementacja BCID2® jest wykonywana po uzyskaniu pozytywnego wyniku posiewu krwi. Jednak niektóre wstępne wyniki (20) sugerują, że wydajność BCID2® w bardzo wczesnym wykrywaniu mikroorganizmów może być wystarczająca po zaledwie kilku godzinach (6-8 godzin) inkubacji posiewów krwi i zanim posiew krwi stanie się pozytywny.

Ponieważ wczesna diagnoza i wczesne zastosowanie skutecznej antybiotykoterapii ma kluczowe znaczenie dla poprawy wyników leczenia pacjentów, celem niniejszego badania jest opracowanie i ocena protokołu klinicznego, który łączy diagnostykę molekularną zakażenia i wczesne oznaczanie mikroorganizmów w posiewach krwi z zaledwie 6 -8 godzin inkubacji, zanim zostaną uznane za pozytywne.

Punkty końcowe

Głównymi punktami końcowymi są:

1. - Określenie zdolności błon BCID 2® do wczesnej identyfikacji mikroorganizmów w BC z kilkugodzinną inkubacją i zanim staną się pozytywne.
2. - Określenie przydatności SeptiCyte® do diagnostyki molekularnej sepsy u krytycznie chorych pacjentów z niejasnym ogniskiem zakaźnym.

Drugorzędowymi punktami końcowymi są

1. - Określenie możliwego wpływu wyników na zarządzanie leczeniem przeciwbakteryjnym.
2. - Aby określić, czy istnieje związek między powszechnymi biomarkerami surowicy (PCT, CRP) a dodatnimi wynikami testów SeptiCyte® i BCID 2®.

Główne kryteria włączenia/wyłączenia

Kryteria przyjęcia:

1. - Dorośli (>16 lat)
2. - Co najmniej 2 kryteria SIRS
3. - RCP (> 10 mg/dl) lub PCT (> 0,5 ng/mL pozaszpitalnie lub > 1,0 ng/mL w zakażeniu szpitalnym) podwyższone

3.- Bez wyraźnego ogniska uzasadniającego sepsę 4.- Wysokie podejrzenie infekcji wymagającej rozpoczęcia leczenia przeciwdrobnoustrojowego.

Kryteria wyłączenia:

1. - Niepobranie próbek w ciągu 12 godzin od podejrzenia zakażenia i podania antybiotyku
2. - Wcześniejsze podanie środków przeciwdrobnoustrojowych w ciągu ostatnich 24 godzin
3. - Udokumentowane lub ewidentne ognisko sepsy przy przyjęciu na OIOM

Procedury:

Jeżeli pacjent spełnia kryteria przyjęcia i nie prezentuje kryteriów wykluczenia, zostanie przyjęty w protokole diagnostycznym algorytmu MESIS.

Nie wymaga podpisu zgody, ponieważ nie są wykonywane żadne specjalne procedury, ani decyzje kliniczne nie będą podejmowane na podstawie wyników badań.

PROTOKÓŁ DIAGNOSTYKI MOLEKULARNEJ I WCZEŚNIEJ KIEROWANE LECZENIE (Patrz załączony Harmonogram Oceny) Po uzyskaniu zwykłych próbek krwi do oznaczania PCR, PCT, liczby białych krwinek (WBC) i posiewów krwi (4 butelki), jak również klinicznie istotnych posiewy, a jeśli kryteria włączenia zostaną spełnione, posiewy krwi (4 butelki) zostaną wysłane wraz z probówką z EDTA z tych uzyskanych do zwykłej analizy do działu mikrobiologii, gdzie zostanie przeprowadzone oznaczenie z użyciem SeptiCyte® i BCID 2® (patrz załączony algorytm).

A) SeptiCyte RAPID® zostanie przeprowadzony u wszystkich pacjentów w momencie odbioru próbki do oddziału mikrobiologii. Wynik testu zostanie zapisany w CRF badania. Wynik ten nie będzie znany lekarzowi prowadzącemu pacjenta.

B) Panel do identyfikacji posiewów krwi BioFire® FilmArray® (BCID 2®) będzie wykonywany na 4 butelkach do posiewów krwi po 6-8 godzinach inkubacji, a zwłaszcza zanim wynik będzie pozytywny. Wynik testu zostanie zapisany w CRF badania. Wynik ten nie będzie znany lekarzowi prowadzącemu pacjenta. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku posiewu krwi należy wykonać nowe oznaczenie BCID 2 i porównać wynik z uzyskanym wcześniej po 6-8 godzinach inkubacji.

UWAGA: W żadnym wypadku otrzymane informacje nie będą wykorzystywane do określania zachowań lub leczenia związanych ze stanem pacjenta. Okres obserwacji Pacjenci będą obserwowani do czasu, gdy zdarzenie, które spowodowało zaburzenie, zostanie uznane za ustąpione. U każdego pacjenta będzie brany pod uwagę tylko pierwszy epizod możliwej sepsy.

Pacjenci zostaną sklasyfikowani jako potwierdzona, prawdopodobna lub możliwa sepsa zgodnie z definicjami z „konferencji konsensusu Międzynarodowego Forum Sepsy na temat definicji zakażeń na oddziale intensywnej terapii. (Calandra T i in. Crit Care Med 2005; 33:1538-1548).

Obliczenie wielkości próbki Według publikacji Kleina Klouwenberga (12) tylko 25% pacjentów z podejrzeniem sepsy, którzy otrzymują antybiotyki przy przyjęciu na OIT, zostaje ostatecznie sklasyfikowanych jako z sepsą ostateczną. Nasze badanie ma nadzieję zidentyfikować co najmniej 40% sepsy u pacjentów z podejrzeniem sepsy. W oparciu o tę różnicę i dla potęgi 90% przy poziomie błędu 5% liczba pacjentów, których należy uwzględnić, wynosi 60.

Biorąc pod uwagę możliwą utratę 20% pacjentów (17 pacjentów) liczba ta wzrasta do 100 pacjentów. Aby zapewnić liczbę pacjentów i siłę badania, zdecydowano o włączeniu kolejnych 20%, co daje w sumie 120 pacjentów.

Plan analizy danych:

Zmienne jakościowe zostaną wyrażone w procentach, natomiast zmienne ilościowe jako średnia i odchylenie standardowe (SD) lub mediana i rozstęp międzykwartylowy 25-75%. Aby określić różnice kliniczne między grupami z i bez BCID 2 i SeptiCyte dodatnich, dla zmiennych kategorycznych zostaną użyte testy Chi-kwadrat i Fisher, a dla zmiennych ilościowych test t-Studenta lub test U Manna-Withneya. Analiza wieloczynnikowa za pomocą binarnej regresji logistycznej zostanie przeprowadzona w celu określenia czynników ryzyka związanych z wczesną obecnością mikroorganizmów w BCID 2 oraz w celu rozpoznania wysokiego ryzyka sepsy za pomocą SeptiCyte.

Na koniec opracowany zostanie empiryczny algorytm leczenia przeciwdrobnoustrojowego dla pacjentów w stanie krytycznym, związany z rodzajem wyizolowanych mikroorganizmów i ewoluującymi genami oporności.

Ograniczenia Głównym ograniczeniem badania jest możliwość wykazania mniejszej liczby chorych z sepsą wśród włączonych osób niż ta, która posłużyła do obliczenia liczebności próby. Taka sytuacja może prowadzić do braku istotności statystycznej ze względu na brak mocy badania. Aby tego uniknąć, planuje się przeprowadzenie analizy pośredniej po osiągnięciu 70% pacjentów. Drugim ograniczeniem jest włączanie pacjentów z niskim odsetkiem. Chociaż uznano, że 6 miesięcy badań terenowych wystarczy, badanie można przedłużyć o kolejne 4 miesiące, aby uzupełnić liczbę pacjentów.

Względy etyczne Badanie jest weryfikowane przez referencyjną Komisję ds. Etyki i Badań Klinicznych. Ze względu na jego zamysł mający na celu poprawę jakości opieki, zwrócono się o odstąpienie od świadomej zgody.