Studie identifikace časné molekulární sepse (MESIS)

Pozadí Sepse byla nedávno předefinována (Sepse 3) jako infekce vedoucí k orgánové dysfunkci (1). Ačkoli tato definice není obecně přijímána všemi výzkumníky (2,3) kvůli možnosti opožděné diagnózy, úmrtnost související s touto entitou by mohla být významně snížena včasným přijetím diagnostických protokolů a vhodným a časným nasazením antimikrobiální terapie (ATB).

Nedávná studie v Katalánsku (4) prokázala výskyt 212 případů sepse na 100 000 obyvatel/rok s nemocniční úmrtností 21 %, což je významně vyšší, vezmeme-li v úvahu pacienty na JIP (40 %) nebo postižené septickým šokem (> 50 %) (5,6). Tyto údaje zdůrazňují současnou důležitost této entity a zdůrazňují potřebu hledat nové alternativy pro včasnou a vhodnou diagnostiku a léčbu, aby měly příznivý dopad na vysokou úmrtnost.

Neúčinná léčba sepse je často způsobena pozdní diagnózou sepse v důsledku inherentní komplikace nespecifických klinických příznaků. Ačkoli se prokalcitonin (PCT) jeví jako adekvátní biomarker pro diagnostiku bakteriální infekce (7,8), různé studie ukazují diskriminaci pouze kolem 80 % (7,8) a nedávné mezinárodní směrnice jeho použití nedoporučují (9, 10,11). Tyto stejné pokyny doporučují použití skóre, jako je SOFA (sekvenční hodnocení selhání orgánů) a qSOFA (zjednodušená verze) na základě přítomnosti změněného vědomí, hypotenze a tachypnoe) pro časnou stratifikaci rizika pacientů s podezřením na infekci.

Systémové zánětlivé syndromy sepse a nesepse se však projevují jako klinicky podobné entity a oba jsou často komplikovány výskytem orgánové dysfunkce. Identifikace sepse proto zůstává subjektivní a může vést k naddiagnostikování sepse a následně k vysokému užívání ATB u pacientů, kteří sepsi nemají a kteří z této léčby nemají prospěch (12).

Dostupnost nových molekulárních technik a automatizace těchto laboratorních analýz stimulovaly hledání biomarkerů souvisejících s odpovědí hostitele na sepsi. Analýza exprese hostitelského genu prostřednictvím RNA transkriptů (transkriptomika) nabízí příležitost v tomto složitém prostředí kriticky nemocného pacienta. Exprese hostitelského genu se mezi septickými pacienty a zdravými jedinci značně liší (13). Ačkoli se však genová exprese mezi pacienty se septickým a neseptickým zánětem do značné míry překrývá, několik rozdílů mezi transkripty pozorovanými u sepse může pomoci odlišit infekci od jiných příčin zánětu [14]. Transkripční test SeptiCyte™ LAB byl vyvinut k diagnostice infekce u kriticky nemocných pacientů s podezřením na sepsi [15]. Je to první test odezvy hostitele založený na metodách kvantitativní reverzní transkriptázy PCR (qRT-PCR), který byl schválen americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA). SeptiCyte™ LAB umožňuje hodnocení reakce hostitele na infekci měřením exprese specifických genů zapojených do imunitní funkce a zánětlivé signalizace v plné krvi. Test spočívá v simultánní amplifikaci 4 RNA transkriptů

1. buněčná adhezní molekula 4 související s karcinoembryonálním antigenem (CEACAM4),
2. liposome-associated membránový protein 1 (LAMP1),
3. placenta-specifický buněčný adhezní protein 8 (PLAC8) a
4. fosfolipáza A2 skupina VII (PLA2G7)

První studie klinického výkonu SeptiCyte™ LAB analyzovala 345 pacientů, kteří byli zařazeni do kohorty Molecular Diagnosis and Sepsis Risk Stratification (MARS) na dvou JIP v Nizozemsku [15]. Pacienti byli kategorizováni jako sepse na základě post-hoc lékařského posouzení dostupných klinických, radiologických a mikrobiologických důkazů [16], které vedly k odhadům AUC (0,77 až 0,99), senzitivity (79 % až 100 %) a specificity ( 33 % až 91 %) se značně lišilo v závislosti na prevalenci sepse, hladině spolehlivosti s ohledem na referenční diagnózu a na tom, zda registrace pacienta probíhala po sobě. V post-hoc podskupině 157 pacientů s kompletními údaji, SeptiCyte™ LAB (AUC 0,88, 95% CI 0,81-0,93) překonal PCT diskriminaci (AUC 0,84, 95% CI 0,76-0,92, p<0,001). Nejlepší rozlišovací schopnosti však bylo dosaženo kombinací obou biomarkerů (AUC 0,89, 95% CI 0,82-0,95, p<0,01). Protože tato analýza trvala asi 6 hodin, byl vyvinut nástroj pro diagnostiku časné sepse (SeptiCyte RAPID (17)), který je založen na měření dvou ze čtyř biomarkerů genové exprese v periferní krvi (PLAC8 a PLA2G7) za použití stejného kvantitativního reverzního transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-qPCR) a úzce koreluje s klinickými výsledky SeptiCyte LAB, ale s mnohem jednodušším pracovním postupem. Na základě výsledků přístroj vydá zprávu se stupnicí pravděpodobnosti sepse. (viz přiložený algoritmus) Tato nová metodologie analýzy spolu s obvyklými biomarkery může zlepšit časnou diagnostiku sepse, odlišit zanícené a septické pacienty.

Test identifikace krevních kultur FilmArray® (BCID®) je molekulární test schválený pro přímou identifikaci patogenů způsobujících BSI z pozitivních BC (18). Nedávno aktualizovaná verze panelu (BCID2®) obsahuje vylepšené identifikační charakteristiky druhů a umožňuje detekci jednoho genu kódujícího β-laktamázu s rozšířeným spektrem (ESBL) a několika genů kódujících karbapenemázu. Panel BCID2® testuje 43 cílů spojených s infekcemi krevního řečiště, včetně gramnegativních bakterií, grampozitivních bakterií, kvasinek a 10 genů antimikrobiální rezistence – vše jedním testem a výsledky jsou k dispozici přibližně za hodinu od pozitivní hemokultury. Kromě toho nabídka panelu BCID2® obsahuje sedm dalších genů rezistence, včetně karbapenemáz, genů rezistence na kolistin a test MREJ umožňuje specifičtější identifikaci MRSA. Nedávná studie (19) hodnotí klinickou výkonnost testu BCID2 pro identifikaci druhů ve 180 pozitivních hemokulturách (BC). Výsledky BCID2 byly v souladu se standardem péče (SOC) v 159/180 (88,3 %) BC; V souladu s výsledky SOC bylo identifikováno 68/74 (91,9 %) a 71/74 (96,0 %) všech vzorků rostoucích s monobakteriálními, grampozitivními nebo gramnegativními patogeny, v daném pořadí. Neshoda souvisela s detekcí dalších patogenů testem BCID2 (n = 4), identifikací neshodných druhů (n = 4) nebo selháním BCID2 detekovat patogeny na panelu (n = 1).

Obvyklá implementace BCID2® se provádí, jakmile je hemokultura pozitivní. Některé předběžné výsledky (20) však naznačují, že účinnost BCID2® při detekci mikroorganismů velmi časně, může být adekvátní pouze po několika hodinách (6–8 h) inkubace hemokultur a předtím, než se hemokultura stane pozitivní.

Vzhledem k tomu, že včasná diagnostika a včasné podání účinné antibiotické terapie má zásadní význam pro zlepšení výsledku pacienta, cílem této studie je vyvinout a vyhodnotit klinický protokol, který kombinuje molekulární diagnostiku infekce a včasné stanovení mikroorganismů v hemokulturách pouze s 6 -8 hodin inkubace, než se zjistí, že jsou pozitivní.

Koncové body

Primární koncové body jsou:

1. - Stanovit schopnost filmových čipů BCID 2® pro časnou identifikaci mikroorganismů v BC po několika hodinách inkubace a předtím, než se stanou pozitivními.
2. - Zjistit schopnost SeptiCyte® pro molekulární diagnostiku sepse u kriticky nemocných pacientů s nejasným infekčním ložiskem.

Sekundární koncové body jsou

1. - Zjistit možný dopad výsledků na management antimikrobiální léčby.
2. - Zjistit, zda existuje souvislost mezi běžnými sérovými biomarkery (PCT, CRP) a pozitivními výsledky SeptiCyte® a BCID 2®.

Hlavní kritéria pro zařazení/vyloučení

Kritéria pro zařazení:

1. - Dospělí (>16 let)
2. - Alespoň 2 kritéria SIRS
3. - zvýšená RCP (> 10 mg/dl) nebo PCT (> 0,5 ng/ml u komunity nebo > 1,0 ng/ml u nozokomiální infekce)

3.- Bez jasného zaměření, které ospravedlňuje sepsi 4.- Vysoké podezření na infekci, která vyžaduje zahájení antimikrobiální léčby.

Kritéria vyloučení:

1. - Nezískání vzorků do 12 hodin po podezření na infekci a podání antibiotik
2. - Předchozí podání antimikrobiálních látek za posledních 24 hodin
3. - Dokumentovaná nebo evidentní sepse zaměření na přijetí na JIP

Postupy:

Pokud pacient splní vstupní kritéria a neuvede vylučovací kritéria, bude přijat v diagnostickém protokolu algoritmu MESIS.

Nevyžaduje podpis souhlasu, protože se neprovádějí speciální postupy, ani se na základě výsledků testů nebudou činit klinická rozhodnutí.

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTICKÝ PROTOKOL A VČASNÁ ŘÍZENÁ LÉČBA (Viz přiložený plán hodnocení) Jakmile byly získány obvyklé krevní vzorky pro stanovení PCR, PCT, počtu bílých krvinek (WBC) a krevních kultur (4 lahvičky), stejně jako klinicky významných kultury, a pokud jsou splněna kritéria pro zařazení, budou hemokultury (4 lahvičky) odeslány spolu se zkumavkou EDTA z těch získaných pro obvyklou analýzu na mikrobiologické oddělení, kde bude provedeno stanovení pomocí SeptiCyte® a BCID 2® (viz přiložený algoritmus).

A) SeptiCyte RAPID® bude proveden u všech pacientů v době příjmu vzorku na mikrobiologické oddělení. Výsledek testu bude uložen ve studijním CRF. Tento výsledek nebude znám ošetřujícímu lékaři pacienta.

B) BioFire® FilmArray® identifikační panel krevní kultury (BCID 2®) bude fungovat na 4 lahvích s hemokulturami po 6-8 hodinách inkubace a zejména předtím, než bude pozitivní. Výsledek testu bude uložen ve studijním CRF. Tento výsledek nebude znám ošetřujícímu lékaři pacienta. Jakmile je hemokultura pozitivní, provede se nové stanovení BCID 2 a výsledek se porovná s výsledkem získaným dříve po 6–8 hodinách inkubace.

POZNÁMKA: Získané informace nebudou v žádném případě použity k definování chování nebo léčby související se stavem pacienta Období sledování Pacienti budou sledováni, dokud nebude událost, která způsobila poruchu, považována za vyřešenou. U každého pacienta bude zvažována pouze první epizoda možné sepse.

Pacienti budou klasifikováni jako potvrzená, pravděpodobná nebo možná sepse podle definic z „Konference Mezinárodního fóra sepse o definicích infekce na jednotce intenzivní péče. (Calandra T a kol. Crit Care Med 2005; 33:1538-1548).

Výpočet velikosti vzorku Podle toho, co publikoval Klein Klouwenberg (12), pouze 25 % pacientů s podezřením na sepsi, kteří po přijetí na JIP dostávají antibiotika, je nakonec klasifikováno jako sepse definitivní. Naše studie doufá, že budeme schopni identifikovat alespoň 40 % sepse u pacientů s podezřením na sepsi. Na základě tohoto rozdílu a pro mocninu 90 % s chybovostí 5 % je počet pacientů potřebných k zahrnutí 60.

Vzhledem k možné ztrátě 20 % pacientů (17 pacientů) se počet zvyšuje na 100 pacientů. Aby byl zajištěn počet pacientů a síla studie, bylo rozhodnuto zahrnout dalších 20 %, takže celkem 120 pacientů.

Plán analýzy dat:

Kvalitativní proměnné budou vyjádřeny v procentech, zatímco kvantitativní proměnné budou vyjádřeny jako průměr a směrodatná odchylka (SD) nebo medián a mezikvartilní rozmezí 25-75 %. Ke stanovení klinických rozdílů mezi skupinami s a bez BCID 2 a pozitivními na SeptiCyte budou pro kategorické proměnné použity Chi-kvadrát a Fisherův test a pro kvantitativní proměnné Studentův t-test nebo Mann-Withneyův U-test. Pro stanovení rizikových faktorů spojených s časnou přítomností mikroorganismů v BCID 2 a pro diagnostiku vysokého rizika sepse pomocí SeptiCyte bude provedena multivariační analýza binární logistickou regresí.

Nakonec bude vyvinut empirický algoritmus antimikrobiální léčby pro kriticky nemocné pacienty související s typem izolovaných mikroorganismů a vyvinutými geny rezistence.

Omezení Hlavním omezením studie je možnost prokázat mezi zahrnutými jedinci menší počet pacientů se sepsí, než jaký byl použit pro výpočet velikosti vzorku. Tato situace by mohla vést k nedostatku statistické významnosti kvůli nedostatečné síle studie. Aby se tomu zabránilo, je plánováno provést průběžnou analýzu, až bude dosaženo 70 % pacientů. Druhým omezením je zahrnutí pacientů v nízké míře. Ačkoli se mělo za to, že 6 měsíců práce v terénu bude dostačujících, studie by mohla být prodloužena o další 4 měsíce, aby se počet pacientů doplnil.

Etická hlediska Studie je posuzována referenčním výborem pro etiku a klinický výzkum. Vzhledem k tomu, že má zlepšit kvalitu péče, byla požadována výjimka z informovaného souhlasu.