Молекулярное исследование ранней идентификации сепсиса (MESIS)

Предпосылки Сепсис недавно был переопределен (сепсис 3) как инфекция, приводящая к органной дисфункции (1). Хотя это определение не принято всеми исследователями (2, 3) из-за возможности поздней диагностики, смертность, связанная с этим заболеванием, может быть значительно снижена за счет раннего принятия диагностических протоколов и надлежащего и раннего использования противомикробной терапии (ATB).

Недавнее исследование в Каталонии (4) показало заболеваемость 212 случаями сепсиса на 100 000 жителей в год с госпитальной смертностью 21%, что значительно выше, если принять во внимание пациентов в отделении интенсивной терапии (40%) или пациентов с септическим шоком (> 50%) (5,6). Эти данные подчеркивают текущую важность этого явления и подчеркивают необходимость поиска новых альтернатив для ранней и надлежащей диагностики и лечения, чтобы оказать благоприятное влияние на высокий уровень смертности.

Неэффективность лечения сепсиса часто связана с поздней диагностикой сепсиса, обусловленной присущим осложнением неспецифическими клиническими признаками. Хотя прокальцитонин (ПКТ), по-видимому, является адекватным биомаркером для диагностики бактериальной инфекции (7, 8), различные исследования показывают дискриминацию только около 80% (7, 8), а последние международные руководства не рекомендуют его использование (9, 8). 10,11). Эти же рекомендации рекомендуют использовать шкалы, такие как SOFA (последовательная оценка органной недостаточности) и qSOFA (упрощенная версия), основанные на наличии измененного сознания, гипотензии и тахипноэ) для ранней стратификации риска у пациентов с подозрением на инфекцию.

Тем не менее, сепсис и системные воспалительные синдромы без сепсиса представляют собой клинически сходные состояния, и оба часто осложняются появлением органной дисфункции. Таким образом, выявление сепсиса остается субъективным и, возможно, приводит к гипердиагностике сепсиса и, следовательно, к более частому использованию АТБ у пациентов, у которых нет сепсиса и которым не помогает это лечение (12).

Наличие новых молекулярных методов и автоматизация этих лабораторных анализов стимулировали поиск биомаркеров, связанных с реакцией хозяина на сепсис. Анализ экспрессии генов-хозяев с помощью транскриптов РНК (транскриптомика) дает возможность в этой сложной ситуации у тяжелобольного пациента. Экспрессия генов-хозяев сильно различается у пациентов с сепсисом и у здоровых людей (13). Однако, хотя экспрессия генов у пациентов с септическим и несептическим воспалением в значительной степени перекрывается, некоторые различия между транскриптами, наблюдаемые при сепсисе, могут помочь отличить инфекцию от других причин воспаления [14]. Анализ транскрипции SeptiCyte™ LAB был разработан для диагностики инфекции у пациентов в критическом состоянии с подозрением на сепсис [15]. Это первый анализ ответа хозяина, основанный на методах количественной ПЦР с обратной транскриптазой (qRT-PCR), одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). SeptiCyte™ LAB позволяет оценить реакцию хозяина на инфекцию путем измерения экспрессии специфических генов, участвующих в иммунной функции и передаче сигналов воспаления в цельной крови. Тест состоит из одновременной амплификации 4 транскриптов РНК.

1. молекула 4 адгезии клеток, родственная карциноэмбриональному антигену (CEACAM4),
2. ассоциированный с липосомами мембранный белок 1 (LAMP1),
3. специфический для плаценты белок клеточной адгезии 8 (PLAC8) и
4. фосфолипаза А2 группы VII (PLA2G7)

В первом клиническом исследовании SeptiCyte™ LAB было проанализировано 345 пациентов, включенных в когорту молекулярной диагностики и стратификации риска сепсиса (MARS) в двух отделениях интенсивной терапии в Нидерландах [15]. Пациентов классифицировали как страдающих сепсисом на основании ретроспективной медицинской оценки имеющихся клинических, радиологических и микробиологических данных [16], в результате чего были получены оценки AUC (от 0,77 до 0,99), чувствительности (от 79% до 100%) и специфичности ( от 33% до 91%) варьировались в широких пределах в зависимости от распространенности сепсиса, уровня достоверности по отношению к эталонному диагнозу и от того, была ли регистрация пациентов последовательной. В ретроспективной подгруппе из 157 пациентов с полными данными SeptiCyte™ LAB (AUC 0,88, 95% ДИ 0,81-0,93) превзошел различение РСТ (AUC 0,84, 95% ДИ 0,76-0,92, р<0,001). Однако наилучшая дискриминационная способность была достигнута при сочетании обоих биомаркеров (AUC 0,89, 95% ДИ 0,82–0,95, р<0,01). Поскольку этот анализ занял около 6 часов, был разработан инструмент ранней диагностики сепсиса (SeptiCyte RAPID (17)), основанный на измерении двух из четырех биомаркеров экспрессии генов в периферической крови (PLAC8 и PLA2G7) с использованием того же количественного обратного анализа. транскрипционная полимеразная цепная реакция (RT-qPCR) и тесно коррелирует с клиническими результатами SeptiCyte LAB, но с гораздо более простым рабочим процессом. По результатам прибор выдает отчет со шкалой вероятности сепсиса. (см. прилагаемый алгоритм) Эта новая методология анализа вместе с обычными биомаркерами может улучшить раннюю диагностику сепсиса, дифференцировать пациентов с воспалением и сепсисом.

Анализ культуры крови FilmArray® (BCID®) — это молекулярный тест, одобренный для прямой идентификации BSI, вызывающих патогены, при положительном РМЖ (18). Недавно обновленная версия панели (BCID2®) включает улучшенные характеристики идентификации видов и позволяет обнаруживать один ген, кодирующий бета-лактамазу расширенного спектра (БЛРС), и несколько генов, кодирующих карбапенемазу. Панель BCID2® тестирует 43 мишени, связанные с инфекциями кровотока, включая грамотрицательные бактерии, грамположительные бактерии, дрожжи и 10 генов устойчивости к противомикробным препаратам — все с помощью одного теста, результаты которого доступны примерно через час после получения положительного результата посева крови. Кроме того, меню панели BCID2® включает семь дополнительных генов устойчивости, включая карбапенемазы, гены устойчивости к колистину, а анализ MREJ позволяет более точно идентифицировать MRSA. В недавнем исследовании (19) оценивается клиническая эффективность анализа BCID2 для идентификации видов в 180 положительных культурах крови (BC). Результаты BCID2 соответствовали стандарту медицинской помощи (SOC) у 159/180 (88,3%). БК; 68/74 (91,9%) и 71/74 (96,0%) всех образцов, растущих монобактериальные, грамположительные или грамотрицательные патогены, соответственно, были идентифицированы, что согласуется с результатами SOC. Несоответствие было связано с обнаружением дополнительных патогенов с помощью анализа BCID2 (n = 4), несоответствующей идентификацией видов (n = 4) или неспособностью BCID2 обнаружить патогены на панели (n = 1).

Обычное внедрение BCID2® выполняется после положительного результата посева крови. Тем не менее, некоторые предварительные результаты (20) предполагают, что характеристики BCID2® при очень раннем обнаружении микроорганизмов могут быть достаточными всего за несколько часов (6-8 ч) инкубации гемокультуры и до того, как культура крови станет положительной.

Поскольку ранняя диагностика и раннее назначение эффективной антибактериальной терапии имеют решающее значение для улучшения результатов лечения пациентов, целью настоящего исследования является разработка и оценка клинического протокола, сочетающего молекулярную диагностику инфекции и раннее определение микроорганизмов в культурах крови всего с 6 -8 часов инкубации, прежде чем они окажутся положительными.

Конечные точки

Основными конечными точками являются:

1. - Определить способность фотоматриц BCID 2® к ранней идентификации микроорганизмов в РМЖ при инкубации в течение нескольких часов и до того, как они станут положительными.
2. - Определить способность SeptiCyte® для молекулярной диагностики сепсиса у пациентов в критическом состоянии с неясным инфекционным очагом.

Вторичные конечные точки

1. - Определить возможное влияние результатов на управление противомикробным лечением.
2. - Чтобы определить, существует ли связь между общими биомаркерами сыворотки (PCT, CRP) и положительными результатами SeptiCyte® и BCID 2®.

Основные критерии включения/исключения

Критерии включения:

1. - Взрослые (> 16 лет)
2. - Минимум 2 критерия SIRS
3. - RCP (> 10 мг/дл) или ПКТ (> 0,5 нг/мл в амбулаторных условиях или > 1,0 нг/мл при внутрибольничной инфекции) повышены

3.- Без четкого очага, оправдывающего сепсис. 4.- Высокое подозрение на инфекцию, требующее начала антимикробной терапии.

Критерий исключения:

1. - Неполучение образцов в течение 12 часов после подозрения на инфекцию и введения антибиотиков
2. - Предыдущий прием противомикробных препаратов за последние 24 часа
3. - Документально подтвержденный или очевидный фокус сепсиса при поступлении в отделение интенсивной терапии

Процедуры:

Если пациент соответствует критериям допуска и не предъявляет критериев исключения, он будет допущен в диагностический протокол алгоритма MESIS.

Он не требует подписи согласия, так как специальные процедуры не проводятся, а клинические решения не принимаются на основании результатов анализов.

ПРОТОКОЛ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И РАННЕЕ НАПРАВЛЕННОЕ ЛЕЧЕНИЕ (см. прилагаемый График обследований) После получения обычных образцов крови для определения ПЦР, ПКТ, количества лейкоцитов (WBC) и культур крови (4 флакона), а также клинически значимых культур, и если критерии включения соблюдены, культуры крови (4 флакона) будут отправлены вместе с пробиркой с ЭДТА из тех, что получены для обычного анализа, в отделение микробиологии, где будет проведено определение с помощью SeptiCyte® и BCID 2® (см. прилагаемый алгоритм).

A) SeptiCyte RAPID® будет проводиться у всех пациентов во время получения образца в отделении микробиологии. Результат теста будет сохранен в CRF исследования. Этот результат не будет известен лечащему врачу пациента.

B) Панель идентификации культур крови BioFire® FilmArray® (BCID 2®) будет работать на 4 флаконах с культурами крови после 6-8 часов инкубации и особенно до того, как она станет положительной. Результат теста будет сохранен в CRF исследования. Этот результат не будет известен лечащему врачу пациента. Новое определение BCID 2 должно быть выполнено после положительного посева крови, и результат должен быть сравнен с результатом, полученным ранее при 6-8 часах инкубации.

ПРИМЕЧАНИЕ. Полученная информация ни в коем случае не будет использоваться для определения поведения или лечения, связанных с состоянием пациента. Период последующего наблюдения Пациенты будут находиться под наблюдением до тех пор, пока событие, вызвавшее расстройство, не будет считаться разрешенным. Для каждого пациента будет рассматриваться только первый эпизод возможного сепсиса.

Пациенты будут классифицированы как подтвержденный, вероятный или возможный сепсис в соответствии с определениями «Консенсусной конференции Международного форума по сепсису по определениям инфекции в отделении интенсивной терапии». (Каландра Т. и др. Крит Кэр Мед 2005; 33:1538-1548).

Расчет размера выборки Согласно публикации Klein Klouwenberg (12), только 25% пациентов с подозрением на сепсис, получающих антибиотики при поступлении в отделение интенсивной терапии, окончательно классифицируются как больные сепсисом. Наше исследование надеется, что сможет выявить не менее 40% случаев сепсиса у пациентов с подозрением на сепсис. Исходя из этой разницы и для мощности 90% с уровнем ошибки 5%, количество пациентов, которые необходимо включить, составляет 60.

С учетом возможной потери 20% пациентов (17 пациентов) число увеличивается до 100 пациентов. Чтобы обеспечить количество пациентов и мощность исследования, было решено включить еще 20%, что составило в общей сложности 120 пациентов.

План анализа данных:

Качественные переменные будут выражены в процентах, а количественные переменные будут выражены как среднее значение и стандартное отклонение (SD) или медиана и межквартильный диапазон 25-75%. Чтобы определить клинические различия между группами с положительными результатами BCID 2 и SeptiCyte и без них, для категориальных переменных будут использоваться тесты Хи-квадрат и Фишер, а для количественных переменных - t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни. Многофакторный анализ с помощью бинарной логистической регрессии будет выполняться для определения факторов риска, связанных с ранним присутствием микроорганизмов в BCID 2, и для диагностики высокого риска сепсиса с помощью SeptiCyte.

Наконец, будет разработан эмпирический алгоритм антимикробного лечения для пациентов в критическом состоянии, связанный с типом выделенных микроорганизмов и развившимися генами резистентности.

Ограничения Основным ограничением исследования является возможность показать меньшее количество пациентов с сепсисом среди включенных лиц, чем то, которое использовалось для расчета размера выборки. Эта ситуация может привести к отсутствию статистической значимости из-за недостаточной мощности исследования. Во избежание этого планируется провести промежуточный анализ при охвате 70% пациентов. Вторым ограничением является включение пациентов по низкой ставке. Хотя считалось, что 6 месяцев полевых исследований будет достаточно, исследование можно было бы продлить еще на 4 месяца, чтобы завершить набор пациентов.

Этические соображения Исследование находится на рассмотрении Комитета по этике и клиническим исследованиям. Из-за его дизайна, направленного на улучшение качества медицинской помощи, был запрошен отказ от информированного согласия.