Estudo Molecular de Identificação Precoce da Sepse (MESIS)

Antecedentes A sepse foi recentemente redefinida (sepse 3) como uma infecção que leva à disfunção orgânica (1). Embora essa definição não seja geralmente aceita por todos os pesquisadores (2,3) devido ao potencial de atraso no diagnóstico, a mortalidade relacionada a essa entidade poderia ser significativamente reduzida pela adoção precoce de protocolos diagnósticos e uso adequado e precoce de terapia antimicrobiana (ATB).

Um estudo recente na Catalunha (4) mostrou uma incidência de 212 casos de sepse por 100.000 habitantes/ano com uma mortalidade hospitalar de 21%, significativamente maior se considerarmos pacientes de UTI (40%) ou afetados por choque séptico (> 50%) (5,6). Esses dados destacam a importância atual dessa entidade e destacam a necessidade de buscar novas alternativas de diagnóstico e tratamento precoce e adequado para impactar favoravelmente na alta taxa de mortalidade.

O tratamento ineficaz da sepse muitas vezes se deve ao diagnóstico tardio da sepse, devido à complicação inerente aos sinais clínicos inespecíficos. Embora a procalcitonina (PCT) pareça ser um biomarcador adequado para o diagnóstico de infecção bacteriana (7,8), diferentes estudos mostram uma discriminação de apenas cerca de 80% (7,8) e diretrizes internacionais recentes não recomendam seu uso (9, 10,11). Essas mesmas diretrizes recomendam o uso de escores, como SOFA (avaliação sequencial de falência de órgãos) e qSOFA (uma versão simplificada) baseada na presença de alteração do estado de consciência, hipotensão e taquipneia) para estratificação precoce de risco de pacientes com suspeita de infecção.

No entanto, as síndromes inflamatórias sistêmicas sepse e não sepse apresentam-se como entidades clinicamente semelhantes, e ambas são frequentemente complicadas pelo aparecimento de disfunção orgânica. Portanto, a identificação da sepse permanece subjetiva e possivelmente leva ao sobrediagnóstico de sepse e, conseqüentemente, ao alto uso de ATB em pacientes que não têm sepse e que não se beneficiam desse tratamento (12).

A disponibilidade de novas técnicas moleculares e a automação dessas análises laboratoriais têm estimulado a busca por biomarcadores relacionados à resposta do hospedeiro à sepse. A análise da expressão gênica do hospedeiro por meio de transcrições de RNA (transcriptômica) oferece uma oportunidade nesse cenário complexo do paciente gravemente enfermo. A expressão do gene hospedeiro difere muito entre pacientes sépticos e indivíduos saudáveis ​​(13). No entanto, embora a expressão gênica entre pacientes inflamados sépticos e não sépticos se sobreponha em grande parte, várias diferenças entre os transcritos observados na sepse podem ajudar a distinguir a infecção de outras causas de inflamação [14]. O ensaio de transcrição SeptiCyte™ LAB foi desenvolvido para diagnosticar infecção em pacientes gravemente enfermos com suspeita de sepse [15]. É o primeiro ensaio de resposta do hospedeiro baseado em métodos quantitativos de transcriptase reversa PCR (qRT-PCR) a ser aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA. O SeptiCyte™ LAB permite a avaliação da resposta do hospedeiro à infecção, medindo a expressão de genes específicos envolvidos na função imunológica e na sinalização inflamatória no sangue total. O teste consiste na amplificação simultânea de 4 transcritos de RNA

1. molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 4 (CEACAM4),
2. proteína de membrana associada a lipossomas 1 (LAMP1),
3. proteína de adesão celular específica da placenta 8 (PLAC8) e
4. fosfolipase A2 grupo VII (PLA2G7)

O primeiro estudo de desempenho clínico do SeptiCyte™ LAB analisou 345 pacientes inscritos como parte da coorte de Diagnóstico Molecular e Estratificação de Risco de Sepse (MARS) em duas UTIs na Holanda [15]. Os pacientes foram classificados como tendo sepse com base em uma avaliação médica post-hoc das evidências clínicas, radiológicas e microbiológicas disponíveis [16], resultando em estimativas para a AUC (0,77 a 0,99), sensibilidade (79% a 100%) e especificidade ( 33% a 91%) variaram amplamente, dependendo da prevalência de sepse, do nível de confiança em relação ao diagnóstico de referência e se o registro do paciente foi consecutivo. Em um subgrupo post-hoc de 157 pacientes com dados completos, SeptiCyte™ LAB (AUC 0,88, 95% CI 0,81-0,93) discriminação de PCT superou (AUC 0,84, IC 95% 0,76-0,92, p<0,001). No entanto, a melhor capacidade discriminatória foi alcançada por uma combinação de ambos os biomarcadores (AUC 0,89, IC 95% 0,82-0,95, p<0,01). Como essa análise demorou cerca de 6 horas, foi desenvolvida uma ferramenta de diagnóstico precoce de sepse (SeptiCyte RAPID (17)) baseada na medição de dois dos quatro biomarcadores de expressão gênica no sangue periférico (PLAC8 e PLA2G7) usando o mesmo método reverso quantitativo transcrição da reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR) e se correlaciona intimamente com os resultados clínicos do SeptiCyte LAB, mas com um fluxo de trabalho muito mais simples. Com base nos resultados, o dispositivo emite um relatório com uma escala de probabilidade de sepse. (ver algoritmo em anexo) Esta nova metodologia de análise, juntamente com os biomarcadores habituais, pode melhorar o diagnóstico precoce da sépsis, diferenciar entre doentes inflamados e sépticos.

O ensaio de identificação de hemocultura FilmArray® (BCID®) é um teste molecular aprovado para identificação direta de patógenos causadores de BSI de BC positivo (18). Uma versão recentemente atualizada do painel (BCID2®) compreende características de identificação de espécies aprimoradas e permite a detecção de um espectro expandido de β-lactamase (ESBL) e vários genes que codificam carbapenemases. O Painel BCID2® testa 43 alvos associados a infecções da corrente sanguínea, incluindo bactérias gram-negativas, bactérias gram-positivas, leveduras e 10 genes de resistência antimicrobiana - tudo com um teste e com resultados disponíveis em cerca de uma hora a partir da hemocultura positiva. Além disso, o menu do painel BCID2® inclui sete genes de resistência adicionais, incluindo carbapenemases, genes de resistência à colistina e um ensaio MREJ permite uma identificação mais específica de MRSA. Um estudo recente (19) avalia o desempenho clínico do ensaio BCID2 para identificação de espécies em 180 hemoculturas (BCs) positivas. Os resultados do BCID2 foram concordantes com o padrão de tratamento (SOC) em 159/180 (88,3%) BCs; 68/74 (91,9%) e 71/74 (96,0%) de todas as amostras crescendo patógenos monobacterianos, Gram-positivos ou Gram-negativos, respectivamente, foram identificados, de acordo com os resultados do SOC. A não concordância foi relacionada à detecção de patógenos adicionais pelo ensaio BCID2 (n = 4), identificação de espécies discrepantes (n = 4) ou falha do BCID2 em detectar patógenos no painel (n = 1).

A implementação usual do BCID2® é feita quando a hemocultura é positiva. No entanto, alguns resultados preliminares (20) sugerem que o desempenho do BCID2® na detecção precoce de microrganismos pode ser adequado com apenas algumas horas (6-8h) de incubação da hemocultura e antes que a hemocultura se torne positiva.

Uma vez que o diagnóstico precoce e a administração precoce de antibioticoterapia eficaz são de crucial importância para melhorar o resultado do paciente, o objetivo do presente estudo é desenvolver e avaliar um protocolo clínico que combine o diagnóstico molecular de infecção e a determinação precoce de microorganismos em hemoculturas com apenas 6 -8 horas de incubação antes de serem considerados positivos.

Terminais

Os endpoints primários são:

1. - Determinar a capacidade dos filmarrays BCID 2® para a identificação precoce de microrganismos em BC com algumas horas de incubação e antes de se tornarem positivos.
2. - Determinar a capacidade do SeptiCyte® para o diagnóstico molecular de sepse em pacientes gravemente enfermos com foco infeccioso incerto.

Os endpoints secundários são

1. - Determinar o possível impacto dos resultados na gestão do tratamento antimicrobiano.
2. - Determinar se existe associação entre biomarcadores séricos comuns (PCT, PCR) e resultados SeptiCyte® e BCID 2® positivos.

Principais critérios de inclusão/exclusão

Critério de inclusão:

1. - Adultos (>16 anos)
2. - Pelo menos 2 critérios SIRS
3. - RCP (> 10 mg/dL) ou PCT (> 0,5 ng/mL na comunidade ou > 1,0 ng/mL na infecção nosocomial) elevada

3.- Sem foco claro que justifique a sepse 4.- Suspeita elevada de infecção que requeira início de tratamento antimicrobiano.

Critério de exclusão:

1. - Falha em obter as amostras dentro de 12 horas após a suspeita da infecção e administração do antibiótico
2. - Administração prévia de antimicrobianos nas últimas 24 horas
3. - Foco de sepse documentado ou evidente na admissão na UTI

Procedimentos:

Caso o paciente preencha os critérios de admissão e não apresente critérios de exclusão, será admitido no protocolo de diagnóstico do algoritmo MESIS.

Não requer assinatura de consentimento, pois não são realizados procedimentos especiais, nem decisões clínicas serão tomadas com base nos resultados dos exames.

PROTOCOLO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR E TRATAMENTO PRECOCE DIRECIONADO (Ver cronograma de avaliações em anexo) Uma vez que as amostras de sangue usuais foram obtidas para a determinação de PCR, PCT, contagem de glóbulos brancos (WBC) e hemoculturas (4 frascos), bem como clinicamente significativas culturas, e se os critérios de inclusão forem atendidos, as hemoculturas (4 frascos) serão enviadas juntamente com um tubo de EDTA daqueles obtidos para as análises habituais ao departamento de microbiologia onde a determinação será realizada com SeptiCyte® e BCID 2® (ver algoritmo em anexo).

A) O SeptiCyte RAPID® será realizado em todos os pacientes no momento do recebimento da amostra no departamento de microbiologia. O resultado do teste será armazenado no CRF do estudo. Este resultado não será conhecido pelo médico assistente do paciente.

B) O painel de identificação de hemocultura BioFire® FilmArray® (BCID 2®) será realizado nos 4 frascos de hemocultura após 6-8 horas de incubação e especialmente antes de se tornar positivo. O resultado do teste será armazenado no CRF do estudo. Este resultado não será conhecido pelo médico assistente do paciente. Uma nova determinação de BCID 2 deve ser realizada assim que a hemocultura for positiva, e o resultado deve ser comparado com o obtido anteriormente com 6-8 horas de incubação.

NOTA: Em nenhum caso as informações recebidas serão utilizadas para definir condutas ou tratamentos relacionados ao estado do paciente Período de Acompanhamento Os pacientes serão acompanhados até que o evento que originou o transtorno seja considerado resolvido. Apenas o primeiro episódio de possível sepse será considerado para cada paciente.

Os pacientes serão classificados como sepse confirmada, provável ou possível de acordo com as definições do "International Sepsis Forum Consensus Conference on Definitions of Infection in the Intensive Care Unit". (Calandra T et al. Crit Care Med 2005; 33:1538-1548).

Cálculo do tamanho da amostra Conforme publicado por Klein Klouwenberg (12), apenas 25% dos pacientes com suspeita de sepse e que recebem antibióticos na admissão na UTI, são finalmente classificados como portadores de sepse definitiva. Nosso estudo espera ser capaz de identificar pelo menos 40% de sepse em pacientes com suspeita de sepse. Com base nessa diferença e para uma potência de 90% com um nível de erro de 5%, o número de pacientes necessário para incluir é 60.

Considerando uma possível perda de 20% dos pacientes (17 pacientes), o número sobe para 100 pacientes. Para garantir o número de pacientes e o poder do estudo, optou-se por incluir mais 20%, totalizando 120 pacientes.

Plano de análise de dados:

As variáveis ​​qualitativas serão expressas como porcentagens, enquanto as variáveis ​​quantitativas serão expressas como média e desvio padrão (DP) ou mediana e intervalo interquartílico de 25-75%. Para determinar as diferenças clínicas entre os grupos com e sem BCID 2 e SeptiCyte positivos, serão utilizados os testes Qui-quadrado e Fisher para variáveis ​​categóricas, e teste t de Student ou teste U de Mann-Withney para variáveis ​​quantitativas. A análise multivariada por regressão logística binária será realizada para determinar os fatores de risco associados à presença precoce de microrganismos no BCID 2 e para o diagnóstico de alto risco de sepse com SeptiCyte.

Por fim, será desenvolvido um algoritmo empírico de tratamento antimicrobiano para pacientes críticos em relação ao tipo de microrganismos isolados e aos genes de resistência evoluídos.

Limitações A principal limitação do estudo é a possibilidade de mostrar um número menor de pacientes com sepse entre os indivíduos incluídos do que o utilizado para calcular o tamanho da amostra. Essa situação pode levar à falta de significância estatística devido à falta de poder do estudo. Para evitar isso, planeja-se realizar uma análise intermediária quando 70% dos pacientes forem atingidos. A segunda limitação é a inclusão de pacientes em uma taxa baixa. Embora tenha sido considerado que 6 meses de trabalho de campo seriam suficientes, o estudo poderia ser estendido por mais 4 meses para completar o número de pacientes.

Considerações éticas O estudo está sob análise do Comitê de Ética e Pesquisa Clínica de referência. Devido ao seu design para melhorar a qualidade do atendimento, foi solicitada uma isenção de consentimento informado.