Badania nad skutkami ostrego spożycia orzechów u otyłych kobiet chorych na cukrzycę (REACT-NUT)

Otyłość jest chorobą wieloczynnikową, w której nadmierne gromadzenie się tkanki tłuszczowej prowadzi do negatywnych skutków zdrowotnych. Uważa się ją za globalny problem zdrowia publicznego, przede wszystkim ze względu na jej związek ze zwiększonym ryzykiem rozwoju innych niezakaźnych chorób przewlekłych (NCD). Szacuje się, że w Brazylii jedna czwarta populacji jest otyła, co czyni ją ważnym czynnikiem ryzyka patologicznego starzenia się.

Główną przyczyną otyłości jest brak równowagi energetycznej pomiędzy spożywanymi i wydatkowanymi kaloriami, a jej częste występowanie wiąże się z brakiem aktywności fizycznej i siedzącym trybem życia. Wiadomo, że zbilansowana dieta, składająca się z naturalnej i minimalnie przetworzonej żywności, jest niezbędna do kontroli wagi. Jednakże w obecnym scenariuszu nastąpił znaczny wzrost spożycia żywności ultraprzetworzonej i spadek spożycia żywności naturalnej i minimalnie przetworzonej, co ma duży wpływ na częstość występowania otyłości.

Otyłość jest jednym z najważniejszych czynników ryzyka cukrzycy typu 2 – choroby, która coraz częściej występuje na całym świecie i jest uważana za jeden z zagrożeń zdrowotnych XXI wieku. Cukrzyca wpływa na zachorowalność i śmiertelność oraz jest głównym czynnikiem ryzyka udaru mózgu, dysfunkcji nerek, chorób układu krążenia, utraty wzroku i neuropatii. Niefarmakologiczne strategie kontroli cukrzycy obejmują zazwyczaj interwencję żywieniową, regularną aktywność fizyczną, rzucenie palenia i utrzymanie prawidłowej masy ciała.

Nagłe spożycie makroelementów może wywołać niekorzystne reakcje nawet u zdrowych osób, co z czasem może prowadzić do chronicznych skutków. W tym kontekście spożycie posiłku o wysokiej zawartości tłuszczów nasyconych (HSFM) odgrywa ważną rolę, ponieważ wiadomo, że przewlekłe spożywanie HSFM przyczynia się do rozwoju otyłości, cukrzycy typu 2, nowotworów i chorób układu krążenia, a także zaostrza przewlekłe zapalenie wywołane insulinoopornością i nadwagą. Ponadto badania pokazują, że HSFM może również indukować endotoksemię metaboliczną i modulować profile krążących mikroRNA. MikroRNA to niekodujące cząsteczki RNA o długości około 22 nukleotydów, które regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym poprzez degradację mRNA lub hamowanie translacji genów docelowych. Zatem mikroRNA mogą przyczyniać się do niepożądanych skutków HSFM.

Biorąc pod uwagę szkodliwy wpływ HSFM na zdrowie, przeprowadzono badania nad ostrą suplementacją żywności o właściwościach przeciwzapalnych i przeciwutleniających, takiej jak sok pomarańczowy i zielona herbata, w celu zminimalizowania negatywnych skutków niezdrowej diety. Badanie przeprowadzone przez naszą grupę badawczą wykazało, że ostra suplementacja zielonej herbaty hamuje ekspresję 62 mikroRNA indukowaną spożyciem HSFM. Analiza bioinformatyczna ujawniła, że ​​te mikroRNA regulują geny związane ze szlakami TGF-beta, CARM1, RSK i BMP. Identyfikacja tych miRNA i ich szlaków molekularnych może pomóc w lepszym zrozumieniu korzyści, jakie składniki diety wpływają na zdrowie i choroby.

Regularne spożywanie orzecha włoskiego (Juglans regia) wiąże się z lepszym zdrowiem układu krążenia i reakcją na insulinę, potencjalnie dzięki regulacji odpowiedzi insulinowej poprzez zmniejszenie aktywności enzymów trawiących węglowodany. Jednakże literatura na temat wpływu orzechów włoskich na reakcje zapalne i przeciwutleniające pozostaje ograniczona i niejednoznaczna. Co więcej, istnieje ograniczona liczba badań oceniających ostre działanie orzechów włoskich i istnieją pewne dowody na pozytywne reakcje. W związku z tym w niektórych, choć nie we wszystkich badaniach, wykazano poposiłkowe osłabienie insulinooporności, poprawę funkcji śródbłonka, stres oksydacyjny i uczucie sytości. Co ciekawe, Torabian i in. zaobserwowali, że ostre spożycie orzechów włoskich zwiększa stężenie polifenoli w osoczu, zwiększa całkowitą zdolność przeciwutleniającą i zmniejsza peroksydację lipidów w osoczu.

Oprócz ograniczonych dowodów dotyczących ostrego działania orzechów włoskich, nie zbadano jeszcze ich wpływu w połączeniu z HSFM na profile metabolomiczne i mikroRNA. Metabolomikę początkowo definiowano jako ilościowy pomiar dynamicznej, wieloparametrycznej odpowiedzi metabolicznej żywych systemów na bodźce fizjopatologiczne lub modyfikację genetyczną. Zatem bezpośrednio odzwierciedla fenotyp konkretnego układu biologicznego na molekularnym poziomie metabolicznym, umożliwiając wykrycie zmian w wcześniej nieznanych, niescharakteryzowanych lub rzadko zgłaszanych metabolitach. Dlatego metabolomika może wygenerować ważną wiedzę na temat mechanizmów działania orzechów włoskich w profilaktyce i leczeniu chorób. To samo dotyczy badania mikroRNA, które mogą pomóc w identyfikacji szlaków wewnątrzkomórkowych związanych z korzystnymi skutkami spożycia orzecha włoskiego.

W świetle tego badanie to dostarczy nowych dowodów dotyczących ostrego wpływu orzechów włoskich na łagodzenie niekorzystnych skutków HSFM. Co więcej, złagodzenie działań niepożądanych HSFM może przynieść znaczne korzyści, szczególnie pacjentom z insulinoopornością, np. osobom otyłym i chorym na cukrzycę.

Ocena, czy ostra suplementacja orzecha włoskiego (Juglans regia) osłabia markery stanu zapalnego, stres oksydacyjny, metabolizm i krążące mikroRNA indukowane przez HSFM u kobiet otyłych i chorych na cukrzycę.

Projekt uzyskał akceptację Komisji Etyki Wydziału Lekarskiego Botucatu. Badanie będzie miało charakter randomizowany i krzyżowy, obejmujące kobiety z otyłością (wskaźnik masy ciała [BMI] ≥ 30) i cukrzycą insulinoniezależną w wieku powyżej 18 lat, rekrutowane w trakcie konsultacji ambulatoryjnych na Wydziale Lekarskim Botucatu. Kryteriami wykluczenia będą: stosowanie suplementów diety, stosowanie kortykosteroidów w ciągu ostatnich 3 miesięcy, nowotwór, niewydolność serca, choroba nerek, choroba wątroby, choroba płuc, choroby neurologiczne, alergia na którykolwiek składnik HSFM lub orzechów włoskich oraz zwykłe spożywanie orzechów włoskich (≤3 razy w tygodniu) w ciągu ostatniego miesiąca.

Liczebność próby oszacowano na podstawie poprzedniego badania, które wykazało 60% redukcję poziomu IL-6 po posiłkach HSFM związanych z sokiem pomarańczowym w porównaniu z grupą kontrolną (bez soku pomarańczowego). Biorąc pod uwagę tę redukcję, błąd typu 1 wynoszący 5% i moc 90%, badanie to obejmie 15 osób.

Pacjenci, którzy podpiszą formularz świadomej zgody (ICF), zostaną poddani ocenie w dwóch punktach czasowych, oddzielonych minimalnym okresem wypłukania wynoszącym jeden tydzień. Na pierwszym spotkaniu, po 10-godzinnym poście, zostanie zaproponowane HSFM z 30 g orzechów włoskich lub bez. W drugim warunek zostanie zamieniony. Podane dawkowanie orzecha odnosi się do zaleceń dziennego spożycia orzechów proponowanych przez różne wytyczne dietetyczne. Prostą randomizację przeprowadzi pielęgniarka niezaangażowana w badanie. HSFM będzie świadczony w przyszpitalnej przychodni, a pacjenci będą zobowiązani do spożycia całego posiłku i wszystkich orzechów włoskich. W trakcie protokołu badania pacjentom zostanie zalecone unikanie spożycia orzechów włoskich przez 2 tygodnie przed pierwszą wizytą w ramach badania.

Próbki krwi będą pobierane w punktach czasowych 0 (bezpośrednio przed posiłkiem), 15 min, 30 min, 60 min i 150 min po interwencjach. Insulina i glukoza w surowicy będą mierzone w punktach czasowych od 0 do 60 minut, podczas gdy biomarkery stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego, krążących mikroRNA i metabolomiki w surowicy będą mierzone w punktach czasowych 0 i 150 minut. Dodatkowo badacze ocenią uczucie sytości za pomocą wizualnej skali analogowej (VAS) we wszystkich punktach czasowych po posiłku.

Analiza metabolomiczna Analizy zostaną przeprowadzone przy użyciu chromatografii cieczowej w systemie Thermo Dionex Ultimate 3000 w połączeniu z dokładnym spektrometrem mas Thermo QExactive Plus o wysokiej rozdzielczości i jonizacją przez elektrorozpylanie, pracującym zarówno w trybie analizy dodatniej, jak i ujemnej.

Analiza krążących mikroRNA Po ekstrakcji RNA badacze wykorzystają ludzką macierz miRNA 4.0 Affymetrix GeneChip® (ThermoFisher Scientific), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Ta tablica zawiera 2578 zestawów sond dla dojrzałych ludzkich miRNA i 2025 zestawów sond dla ludzkich pre-miRNA (stem-loop). W tej macierzy znajdują się również sondy do wykrywania obecności snoRNA i scaRNA (w sumie 1996). GeneChips będą skanowane przy użyciu skanera Affymetrix GeneChip G3000 7G, ustawionego na przechwytywanie intensywności sygnału dla miRNA. Surowe dane dotyczące intensywności zostaną zaimportowane do konsoli wyrażeń Affymetrix (wersja 1.4.1.46) do wstępnego przetwarzania sygnału, które obejmuje korekcję tła przy użyciu solidnego algorytmu średniej wielomacierzowej (RMA), podsumowanie mediany polerowania sond w celu uzyskania wartości sygnału oraz normalizację kwantyli w wielu tablicach. Wywołanie wykrywania siły sygnału miRNA zostanie przeprowadzone przy użyciu algorytmu Affymetrix „Detection Above Tło” (DABG), który generuje wartość p dla każdego prawdopodobieństwa sygnału powyżej tła. Ta metoda będzie zgodna z zalecanym protokołem producenta. Analizy będą prowadzone w Monash w Hudson Genomics.

Analiza statystyczna Dane zostaną przedstawione jako średnia i odchylenie standardowe w przypadku rozkładu normalnego, mediana i percentyle 25–75% w przypadku braku rozkładu normalnego lub jako wartości procentowe. Aby porównać dwie grupy (z orzechami i bez orzechów), badacze wykorzystają test t-Studenta dla danych o rozkładzie normalnym, test Manna-Whitneya dla danych o rozkładzie innym niż normalny oraz test Chi-kwadrat do porównań zmiennych kategorycznych. Dodatkowo badacze zastosują uogólnione równania estymujące (GEE) do oceny powtarzalnych pomiarów. Analizy danych zostaną przeprowadzone przy użyciu JAMOVI v 2.3.21, z poziomem istotności ustawionym na 5%.