Ferramenta de diagnóstico baseada em microbioma para triagem de câncer colorretal (GUILTI) (GUILTI)

O cancro colorretal (CCR) é o terceiro cancro mais comum e a segunda causa mais comum de morte por cancro em todo o mundo, com quase 2 milhões de novos casos e um milhão de mortes em 2020. Nas últimas décadas, programas de rastreio de base populacional para populações de risco médio estabeleceram-se como uma estratégia eficaz para reduzir a incidência e a mortalidade do CCR através da detecção precoce do cancro. O teste imunoquímico fecal (FIT), ferramenta diagnóstica de referência na maioria dos países, ainda tem um rendimento diagnóstico abaixo do ideal, com adenomas perdidos e, principalmente, colonoscopias desnecessárias. Por estas razões, nos últimos anos, a identificação de novos biomarcadores não invasivos é absolutamente defendida no campo do CCR. Um grande conjunto de evidências mostra que as alterações do microbioma intestinal e o enriquecimento de táxons específicos (por ex. Fusobacterium nucleatum, Parvimonas micra e outros) estão envolvidos na patogênese do CCR. Além disso, estudos recentes, incluindo meta-análises metagenômicas do nosso grupo, descobriram assinaturas microbianas comuns capazes de discriminar de forma reprodutível entre pacientes com CCR e controles saudáveis. Com base nesta evidência, as diretrizes internacionais defenderam recentemente a exploração de biomarcadores baseados em microbiomas para o rastreio do CCR na prática clínica, mas tais estudos ainda não estão disponíveis até à data.

O objetivo principal é desenvolver uma ferramenta de diagnóstico baseada no microbioma intestinal para a identificação de CCR e adenomas colorretais avançados.

Os objetivos secundários são:

• Para associar o FIT aos resultados clínicos e de colonoscopia
• Para caracterizar o microbioma intestinal dos pacientes inscritos
• Associar assinaturas de microbioma a resultados clínicos e de colonoscopia. Este é um estudo observacional multicêntrico prospectivo, no qual os pacientes serão selecionados entre aqueles inscritos no programa nacional de rastreamento de câncer colorretal (CRC) e entre aqueles encaminhados a todos os centros envolvidos neste estudo para colonoscopia de rastreamento. Pacientes com todos os critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão (detalhados na seção específica deste site) serão considerados para este estudo. N = 1.202 pacientes serão inscritos, com base no cálculo do tamanho da amostra e incluindo um grupo de validação. Serão necessários N=911 pacientes, e adicionaremos 91 pacientes para cobrir um potencial abandono de 10% e 200 pacientes como um grupo de validação (20% da coorte do estudo). Os pacientes inscritos nesta coorte de validação terão os mesmos critérios de exclusão e inclusão de outros pacientes e serão submetidos aos mesmos procedimentos do estudo. No início do estudo, todos os pacientes inscritos fornecerão uma amostra fecal (coletada usando um tampão para preservação do genoma) dentro de 2 semanas a partir da inscrição e serão armazenadas a -80°C em cada centro clínico e receberão IDs não identificados. Além disso, serão registradas características demográficas, clínicas e dados laboratoriais.

Para todos os pacientes inscritos, os médicos registrarão os seguintes dados:

• História familiar de CCR;
• Comorbidades;
• Ingestão de medicamentos;
• Sintomas gastrointestinais (GI) e de alarme (anemia ferropriva, hematoquezia, perda de peso inexplicável, dor abdominal, mudança repentina nos hábitos intestinais);
• Hábitos alimentares;
• Tabagismo e consumo de álcool;
• IMC (índice de massa corporal);
• Dados quantitativos de FIT;
• Informações sobre FIT e/ou colonoscopias anteriores e/ou colonoscopias virtuais.

Todos os pacientes inscritos serão submetidos a uma colonoscopia dentro de 4 semanas a partir do FIT positivo, após colonoscopia características endoscópicas (tamanho, local, formato com base na classe de Paris). e serão coletadas características histopatológicas das lesões detectadas. Adenomas colorretais avançados serão definidos como adenomas maiores ou iguais a 10 mm, e/ou com componentes vilosos maiores ou iguais a 25%, e/ou displasia de alto grau. -tomografia corporal para estadiamento da doença e será encaminhada para via oncológica na prática clínica, sendo coletados os seguintes dados: presença de metástase linfonodal e de metástase em órgão, TNM Classe (Tumor-Nó-Metástase)..A fase de inscrição durará 48 meses. Ao final da fase de inscrição, os investigadores realizarão a análise do microbioma, e os investigadores combinarão dados clínicos, endoscópicos e microbianos por meio de estatística e aprendizado de máquina algoritmos para identificar biomarcadores microbianos específicos associados ao CCR e adenomas colorretais avançados, para desenvolver uma nova ferramenta de diagnóstico, baseada em um sistema de pontuação.

Os resultados do estudo estão detalhados na seção específica deste site. A análise do microbioma será realizada com técnicas de sequenciamento shotgun. Além disso, para obter um painel de espécies microbianas principalmente associadas ao CCR e aos adenomas colorretais avançados, os investigadores explorarão aplicações de aprendizado de máquina, por exemplo, usando os algoritmos Random Forest amplamente adotados, bem como abordagens meta-analíticas integrando nossa grande coorte com publicações anteriormente publicadas coortes metagenômicas. Um painel definido de espécies microbianas principalmente associadas ao CCR e aos adenomas colorretais avançados fornecerá uma pontuação de risco abrangente baseada nas características do microbioma, com dois objetivos específicos, para melhorar a precisão dos testes da ferramenta de diagnóstico FIT e para ser facilmente interpretável pelos médicos. os dados clínicos coletados serão combinados estatisticamente para classificar as características microbianas da mais para a menos associada.

Estas classificações serão exploradas para avaliar o perfil do microbioma de um novo indivíduo e para relatar quantas das espécies definidas no painel anterior são encontradas e, portanto, estão ligadas ao CCR e aos adenomas colorretais avançados. As associações entre espécies identificadas e fabricantes de interesse serão estimadas através de métodos robustos de análise estatística, como correlação parcial ou modelagem linear. Em seguida, as associações serão classificadas e comparadas entre marcadores para a mesma espécie, dando uma pontuação de prioridade para cada espécie. Será dedicado especial cuidado à identificação de potenciais marcadores de confusão conhecidos por estarem associados a diferenças na composição do microbioma, por exemplo, a idade, que devem ser utilizados como covariáveis ​​na modelação estatística. Além da modelagem estatística, as associações entre espécies e marcadores também serão avaliadas por meio de abordagens de ML, particularmente aquelas que fornecem pontuações de importância de características para as características de entrada (espécies, no nosso caso), que podem ser usadas para classificar as espécies entre os diferentes marcadores ( por exemplo Floresta Aleatória, LASSO, etc). As variáveis ​​contínuas serão relatadas como média ± desvio padrão ou como mediana e intervalo interquartil (IQR), e as variáveis ​​categóricas foram resumidas como frequência e porcentagem. As comparações das variáveis ​​​​serão feitas por teste t (ou Mann-Whitney/Kruskal-Wallis), teste Qui-quadrado ou teste exato de Fisher, conforme apropriado. Um valor de p <0,05 será considerado para indicar significância estatística. Modelos de regressão logística serão realizados para identificar a presença de variáveis ​​independentemente associadas aos desfechos. As variáveis ​​consideradas nos modelos foram selecionadas por meio de seleção de modelos passo a passo e orientadas pela relevância clínica. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS v. 28.0 para Macintosh (SPSS Inc., Chicago, EUA).

Os investigadores empregarão uma estrutura de aprendizado de máquina (ML) baseada no pacote Python scikit-learn usando uma abordagem de validação cruzada com 100 iterações de bootstrap e uma divisão aleatória 80/20 em dobras de treinamento e teste. Os algoritmos de classificação e regressão de ML serão treinados em abundâncias relativas taxonômicas em nível de espécie de microbioma e perfis de potencial funcional. As abundâncias taxonômicas em nível de espécie serão estimadas pelo MetaPhlAn 4 (usando os últimos bancos de dados disponíveis, atualmente denominados Oct22) e normalizadas usando a transformação arcsin-sqrt para dados de composição. Perfis de potencial funcional serão estimados usando a versão mais recente do HUMAnN 4 e os investigadores considerarão estimativas de abundância de famílias de genes microbianos únicos e de vias metabólicas. Correlações parciais entre espécies e marcadores serão calculadas usando o índice de Spearman, para evitar vieses devido a valores discrepantes e corrigidas para covariáveis, como sexo, idade e índice de massa corporal, conhecidas por terem impacto na composição do microbioma. Os valores de correlação parcial serão corrigidos utilizando o procedimento de Benjamini-Hochberg para a taxa de falsas descobertas.